ELISA實(shi)驗(yan)步(bu)驟及注意事(shi)項:

1、固相載體選擇

聚苯乙烯：具有較強(qiang)的吸附蛋(dan)白質的性能，抗體或(huo)抗原吸附其上后仍保(bao)留(liu)原來的免(mian)疫學活性。

聚(ju)氯乙烯：聚(ju)氯乙烯對蛋白質的吸附(fu)性能比(bi)聚(ju)苯乙烯高，但(dan)空白值也略高溫物。

良好(hao)的(de)ELISA板(ban)應該是吸附(fu)性能好(hao)，空白值低，孔底透明度高，各(ge)板(ban)之間(jian)、同(tong)一板(ban)各(ge)孔之間(jian)性能相(xiang)近。

2、包被

①板孔的選擇：ELISA配套的微孔板。

②抗體選擇(ze)：何針(zhen)選擇(ze)支(zhi)持ELISA實驗的抗體，根據推(tui)薦濃度(du)稀(xi)釋或(huo)摸索最適(shi)濃度(du)。

③包被緩沖液：pH9.6碳(tan)酸鹽緩沖液或pH7.2磷(lin)酸鹽緩沖液。

④包被溫度：2-8 ℃過夜包被或(huo)室(shi)溫（37℃）包被2h。

⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的(de)性質可有很大的(de)變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

3、封閉

①包被(bei)之(zhi)后一定(ding)要立即封(feng)閉（封(feng)閉非特(te)異性抗體）。

②選(xuan)擇效果較好(hao)的封閉(bi)劑(ji)（細胞培養(yang)級BSA、Tween等(deng)）。

4、加樣及孵育

①加(jia)(jia)樣(yang)時(shi)應(ying)將所加(jia)(jia)物加(jia)(jia)在(zai)ELISA板(ban)孔的底部(bu)，避免加(jia)(jia)在(zai)孔壁上部(bu)，并注意不可濺(jian)出，不可產生氣(qi)泡。

②孵育的時(shi)間及溫度參考試劑(ji)盒說明書。如(ru)有條(tiao)件，建議加樣孵育時(shi)使用shaker震(zhen)蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉(zhuan)速(su)在(zai)500±50rpm。

③檢測抗體、酶標物的(de)稀釋比例(li)、孵(fu)育溫度(du)、孵(fu)育時間(jian)嚴格(ge)根據說明書提示(shi)。

④洗板對于ELISA來說，是極其關鍵(jian)的一(yi)步，保證ELISA的特異性。

⑤封板膜(mo)一(yi)定要一(yi)次一(yi)換，切勿二(er)次甚至多次使用，以防交叉污染。

5、顯色(se)和(he)終材暗(an)總止

①使用前需(xu)檢查，底物(wu)在(zai)加入96孔板之前應(ying)為無(wu)色透明。

②顯色底(di)物需現(xian)配現(xian)用，避免污染。

③孵(fu)育(yu)時(shi)間，說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)上為參考范圍(wei)，具體需要根據實驗(yan)條件自行摸(mo)索。可(ke)參考標曲濃(nong)度孔的(de)顏色，變為藍色較明(ming)(ming)顯時(shi)即可(ke)。