小鼠組織金屬蛋白酶抑制因子4(TIMP4)試劑盒

本試(shi)劑盒僅供體外研究使(shi)用，不用于臨床(chuang)診斷

本試劑(ji)盒用于體外定量檢測血(xue)清、血(xue)漿、組(zu)織(zhi)勻漿及相關液體樣本中小鼠組(zu)織(zhi)金屬蛋白酶(mei)抑制因(yin)子4(TIMP4)的(de)含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及(ji)時(shi)檢查所(suo)有物(wu)品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經(jing)過(guo)大量正常標(biao)本(ben)(ben)檢驗，標(biao)本(ben)(ben)的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范(fan)圍內(nei)，實驗過(guo)程中直接(jie)取(qu)50μL樣(yang)本(ben)(ben)上(shang)樣(yang)即可。當有部分樣(yang)本(ben)(ben)值超(chao)過(guo)大標(biao)準品濃度時(shi)，可用樣(yang)本(ben)(ben)稀(xi)釋液將(jiang)標(biao)本(ben)(ben)進行適當稀(xi)釋后再(zai)進行實驗。

檢測前準備工作：

1.請提前20分(fen)鐘從冰箱(xiang)中取出試劑盒，平衡(heng)至室溫。

2.從(cong)冰箱中取出(chu)的(de)濃(nong)(nong)縮(suo)洗(xi)滌液(ye)(ye)可能有結晶(jing)，屬于正(zheng)常(chang)現象；放置(zhi)室溫，輕搖均勻(yun)，待結晶(jing)溶解后再配置(zhi)洗(xi)滌液(ye)(ye)。可將20ml濃(nong)(nong)縮(suo)洗(xi)滌液(ye)(ye)用蒸餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)稀釋(shi)配置(zhi)成400ml工(gong)作濃(nong)(nong)度的(de)洗(xi)滌液(ye)(ye)，未用完的(de)放回(hui)4℃

3.20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液的稀(xi)釋(shi)：蒸餾水按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液加19份蒸餾水。

實驗原理：

小鼠組織金屬蛋白酶抑制因子4(TIMP4)試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗(kang)體一步夾(jia)心法酶(mei)(mei)聯(lian)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先(xian)包被小鼠組織金屬(shu)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)抑制(zhi)因子(zi)4(TIMP4)捕獲抗(kang)體的(de)(de)(de)包被微孔中(zhong)，依次加入標(biao)本(ben)、標(biao)準品(pin)(pin)、HRP標(biao)記的(de)(de)(de)檢測抗(kang)體，經過(guo)溫(wen)育并洗滌。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過(guo)氧化物酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)催化下(xia)(xia)轉(zhuan)化成藍(lan)色(se)，并在(zai)酸的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)下(xia)(xia)轉(zhuan)化成終(zhong)的(de)(de)(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)(de)(de)深淺(qian)和(he)樣品(pin)(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)小鼠組織金屬(shu)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)抑制(zhi)因子(zi)4(TIMP4)呈正相關。用(yong)酶(mei)(mei)標(biao)儀在(zai)450nm 波長下(xia)(xia)測定吸光度（OD 值），計算樣品(pin)(pin)濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離子水(shui)

樣本處理及要求：

1.血清：將收(shou)集于血清分(fen)離管的全血標本在室溫放(fang)置2小時或(huo)(huo)4℃過夜，然(ran)后1000×g離心20 分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即可，或(huo)(huo)將上(shang)清置于-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反(fan)復凍融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝素(su)作(zuo)為抗凝劑采(cai)集標(biao)本，并將(jiang)(jiang)標(biao)本在采(cai)集后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上(shang)清即可(ke)檢測，或(huo)將(jiang)(jiang)上(shang)清置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避(bi)免反復凍(dong)融。

3.組(zu)織(zhi)勻漿：用預冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)，去除殘留血液（勻漿中(zhong)裂(lie)解(jie)的(de)(de)紅細胞會(hui)影響測(ce)量結果），稱重(zhong)后將組(zu)織(zhi)剪碎。將剪碎的(de)(de)組(zu)織(zhi)與對應(ying)體(ti)積的(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)重(zhong)量體(ti)積比，比如1g的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣品對應(ying)9mL的(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根(gen)據實驗(yan)需要(yao)適當調整，并做好記(ji)錄。推薦(jian)在(zai)PBS中(zhong)加(jia)入蛋白酶(mei)抑制劑(ji)）加(jia)入玻璃勻漿器(qi)中(zhong)，于(yu)冰上充分研磨。為了進(jin)一步裂(lie)解(jie)組(zu)織(zhi)細胞，可以對勻漿液進(jin)行超聲(sheng)破碎，或(huo)反復凍融。后將勻漿液于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(ce)。

4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。

5.其(qi)它生(sheng)物標本：1000×g離心20分鐘(zhong)，取上清即可(ke)檢測。

6.樣品外觀：樣品應(ying)(ying)清澈(che)透(tou)明，懸浮物(wu)應(ying)(ying)離心去除。

7.樣品保(bao)存(cun)：樣品收集后若在1周(zhou)內進行(xing)檢測(ce)的可保(bao)存(cun)于4℃，若不能(neng)及時檢測(ce)，請按(an)一(yi)次使(shi)用量分裝，凍存(cun)于-20℃（1個(ge)月內檢測(ce)），或-80℃（6個(ge)月內檢測(ce)），避免反(fan)復凍融(rong)，標本溶血會(hui)影響后檢測(ce)結果，因(yin)此(ci)溶血標本不宜進行(xing)此(ci)項檢測(ce)。

注意事項：

1.嚴(yan)格按照規(gui)定的時間(jian)和溫度進行溫育(yu)以(yi)保(bao)證準(zhun)確(que)結果(guo)。所(suo)有試劑都必(bi)須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷藏保(bao)存試劑。

2.洗(xi)板不(bu)正(zheng)確(que)可以導致不(bu)準確(que)的結果。在加入底物(wu)前(qian)確(que)保盡量吸干孔內(nei)液體(ti)。溫育過程中(zhong)不(bu)要讓微孔干燥掉。

3.消除(chu)板(ban)底(di)殘留(liu)的液體和手指(zhi)印，否則影響(xiang)OD值(zhi)。

4.底(di)物顯色液應呈無(wu)色或很淺的顏色，已(yi)經變藍(lan)的底(di)物液不能使用。

5.避(bi)免(mian)試劑(ji)和標本的交(jiao)叉污染以免(mian)造成錯(cuo)誤結果。

6.在儲存和溫育時避(bi)免(mian)強光(guang)直接照射。

7.平衡至室溫后再打開密(mi)封(feng)袋以防水(shui)滴凝聚在冷(leng)板條上(shang)。

8.任(ren)何(he)反(fan)應試劑不能接(jie)觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的(de)強烈氣體。任(ren)何(he)漂白成分(fen)都會破(po)壞試劑盒(he)中反(fan)應試劑的(de)生物活性。

9.不能使用過期產品。

10.如(ru)果(guo)可能傳播(bo)疾病，所有的樣(yang)品都應管(guan)理(li)好，按(an)照規(gui)定的程序處理(li)樣(yang)品和檢(jian)測裝置。

操作步驟：

1．從(cong)室溫平衡(heng)60min后的(de)鋁箔袋(dai)中取(qu)出所需(xu)板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自封袋(dai)密封放回4℃。

2．設置標(biao)準(zhun)品孔(kong)(kong)和(he)樣本孔(kong)(kong)，標(biao)準(zhun)品孔(kong)(kong)各加不(bu)同濃(nong)度的標(biao)準(zhun)品50μL。

3．樣本(ben)孔中a加入(ru)待測樣本(ben)50μL；空白孔不加。

4．除空白孔(kong)外(wai)，標準(zhun)品孔(kong)和樣本孔(kong)中(zhong)每孔(kong)加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜(mo)封住反應(ying)孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋(guo)或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸(xi)(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)干(gan)，每孔加(jia)滿洗(xi)滌液（350μL），靜(jing)置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌液，吸(xi)(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)干(gan)，如此重復洗(xi)板5次(ci)（也(ye)可用(yong)洗(xi)板機洗(xi)板）。

6．每孔(kong)加入(ru)底(di)物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7．每孔加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制(zhi)標(biao)(biao)準曲線(xian)(xian)：在Excel工作(zuo)表中(zhong)，以(yi)標(biao)(biao)準品(pin)濃(nong)度作(zuo)橫坐標(biao)(biao)，對(dui)應OD值作(zuo)縱坐標(biao)(biao)，繪制(zhi)出(chu)標(biao)(biao)準品(pin)線(xian)(xian)性回歸曲線(xian)(xian)，按曲線(xian)(xian)方程計算各樣本濃(nong)度值。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：低檢(jian)測濃(nong)度小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結構類似物交(jiao)叉(cha)反應。

4.重復性：板內變(bian)異系數小于10% ，板間變(bian)異系數小于15% 。

技術小提示：

1.當混合或重溶蛋白溶液時，盡量避(bi)免起(qi)沫。

2.小鼠組織金屬蛋白酶抑制因子4(TIMP4)試劑盒為了(le)避免(mian)交叉感染，配置不(bu)(bu)同(tong)濃度(du)標準品、上樣、加不(bu)(bu)同(tong)試劑都需(xu)要(yao)更換槍頭。另外不(bu)(bu)同(tong)試劑請(qing)分別使用(yong)不(bu)(bu)同(tong)的(de)移液槽。

3.每次(ci)孵育時，請正(zheng)確(que)使用封(feng)板膠(jiao)可保證結果的準確(que)性。

4.混合后的(de)顯色底(di)物(wu)在(zai)上板前(qian)應為無(wu)色，請避光保存(cun)；假如微孔(kong)板后，將(jiang)由物(wu)色變成不同深度的(de)藍色。

5.終止(zhi)液上板(ban)(ban)順(shun)序應同(tong)顯色底物(wu)上板(ban)(ban)順(shun)序一致；加(jia)入終止(zhi)液后(hou)，孔(kong)內顏色由藍變黃；若(ruo)孔(kong)內有綠色，則表明(ming)孔(kong)內液體未混勻(yun)；請充分混合。

說明：

1.由于現有(you)條件及科學技術水平(ping)尚不能(neng)對所有(you)供(gong)貨商提供(gong)的所有(you)原(yuan)料進行全面的鑒定與分析，本(ben)產(chan)品可(ke)能(neng)存在一定的質(zhi)量技術風險。

2.實驗結果(guo)與(yu)試劑的(de)有(you)效性、實驗者的(de)相關操作(zuo)以及當時的(de)實驗環境(jing)密切(qie)相關，請務必準備充(chong)足的(de)標本備份。

3.不同批次的同一(yi)產品可能會(hui)有少許差別，如：檢測限、靈敏(min)度(du)以及顯色時(shi)間等(deng)，請依據試劑(ji)盒內說明(ming)(ming)書進(jin)行(xing)實(shi)驗操(cao)作(zuo)，網(wang)站電(dian)子版說明(ming)(ming)書僅作(zuo)參考(kao)。

4.只有(you)全部使用(yong)本試劑(ji)盒配(pei)套(tao)試劑(ji)才能保證(zheng)檢測(ce)效果，不能混用(yong)其(qi)他制(zhi)造商的產品。只有(you)嚴格遵守本試劑(ji)盒的實驗說明才會(hui)得到檢測(ce)結果。