豬左右決定因子1(LEFTY1)試劑盒

本(ben)試劑(ji)盒僅供體外研究使(shi)用，不用于臨床診斷

本(ben)試劑盒用(yong)于體(ti)(ti)外定量檢測血(xue)(xue)清、血(xue)(xue)漿、組(zu)織勻(yun)漿及相(xiang)關液體(ti)(ti)樣本(ben)中豬左右(you)決定因子1(LEFTY1)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打(da)開包裝后請及時檢(jian)查(cha)所有物品是(shi)否(fou)齊全。

2. 標(biao)準品濃度依(yi)次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過(guo)大(da)量正常(chang)(chang)標(biao)本(ben)(ben)檢驗(yan)(yan)，標(biao)本(ben)(ben)的正常(chang)(chang)濃度值(zhi)均(jun)在試劑盒提供(gong)的檢測范圍內，實驗(yan)(yan)過(guo)程中直(zhi)接取(qu)50μL樣(yang)本(ben)(ben)上樣(yang)即可。當(dang)有(you)部分樣(yang)本(ben)(ben)值(zhi)超過(guo)大(da)標(biao)準品濃度時，可用樣(yang)本(ben)(ben)稀釋液將標(biao)本(ben)(ben)進(jin)行適當(dang)稀釋后再進(jin)行實驗(yan)(yan)。

檢測前準備工作：

1.請提前(qian)20分鐘從冰箱中取出試劑(ji)盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中(zhong)取出(chu)的(de)濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)可(ke)能有結晶，屬于正常現象；放(fang)置室溫，輕搖均勻，待(dai)結晶溶解后再配置洗滌液(ye)。可(ke)將20ml濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)用蒸餾(liu)水或去離(li)子水稀釋配置成400ml工作濃(nong)度(du)的(de)洗滌液(ye)，未用完的(de)放(fang)回(hui)4℃

3.20×洗(xi)滌緩沖(chong)(chong)液的稀(xi)釋：蒸餾水按(an)1：20稀(xi)釋，即(ji)1份20×洗(xi)滌緩沖(chong)(chong)液加(jia)19份蒸餾水。

實驗原理：

豬左右決定因子1(LEFTY1)試劑盒采(cai)用(yong)(yong)雙抗(kang)(kang)體一步(bu)夾心法酶(mei)(mei)(mei)聯免疫吸附試(shi)驗（ELISA）。往預先包(bao)(bao)被豬左(zuo)右(you)決定因子(zi)1(LEFTY1)捕獲抗(kang)(kang)體的(de)(de)包(bao)(bao)被微孔中，依(yi)次加入(ru)標(biao)(biao)(biao)本、標(biao)(biao)(biao)準品、HRP標(biao)(biao)(biao)記的(de)(de)檢(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)體，經過溫(wen)育并洗滌。用(yong)(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在(zai)過氧化(hua)物(wu)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)催化(hua)下(xia)轉化(hua)成藍色，并在(zai)酸的(de)(de)作用(yong)(yong)下(xia)轉化(hua)成終的(de)(de)黃色。顏(yan)色的(de)(de)深淺和樣(yang)品中的(de)(de)豬左(zuo)右(you)決定因子(zi)1(LEFTY1)呈正相關(guan)。用(yong)(yong)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)儀在(zai)450nm 波(bo)長下(xia)測(ce)(ce)定吸光(guang)度（OD 值），計算樣(yang)品濃(nong)度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶(mei)標儀（450nm）

2.高(gao)精(jing)度加樣器及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水(shui)或去(qu)離子水(shui)

樣本處理及要求：

1.血(xue)(xue)(xue)清：將(jiang)收集于血(xue)(xue)(xue)清分(fen)離管(guan)的(de)全血(xue)(xue)(xue)標(biao)本在(zai)室溫(wen)放置2小時(shi)或(huo)4℃過夜，然后1000×g離心20 分(fen)鐘，取上清即可，或(huo)將(jiang)上清置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。

2.血(xue)漿：用EDTA或(huo)肝素作(zuo)為抗凝劑(ji)采(cai)集標本，并將(jiang)標本在采(cai)集后的(de)30分鐘內于2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)即可(ke)檢測，或(huo)將(jiang)上(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融(rong)。

3.組(zu)織(zhi)勻漿：用預(yu)冷(leng)的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)，去除殘留血(xue)液(ye)（勻漿中(zhong)裂(lie)解(jie)的(de)(de)紅細胞會(hui)影響測(ce)量結果），稱(cheng)重后將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)(de)組(zu)織(zhi)與(yu)對(dui)(dui)應(ying)體積(ji)的(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)重量體積(ji)比(bi)，比(bi)如(ru)1g的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣品對(dui)(dui)應(ying)9mL的(de)(de)PBS，具體體積(ji)可根據實驗需(xu)要適當調整，并做好記(ji)錄。推薦在PBS中(zhong)加入(ru)(ru)蛋白酶(mei)抑制劑）加入(ru)(ru)玻(bo)璃勻漿器中(zhong)，于(yu)冰上充分(fen)研(yan)磨。為(wei)了進一步裂(lie)解(jie)組(zu)織(zhi)細胞，可以(yi)對(dui)(dui)勻漿液(ye)進行(xing)超聲(sheng)破碎(sui)，或反復凍融。后將(jiang)勻漿液(ye)于(yu)5000×g離(li)心(xin)5~10分(fen)鐘，取上清檢測(ce)。

4.細胞培養物上(shang)清(qing)：請1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即可檢測，或將上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢(jian)測。

6.樣品外(wai)觀：樣品應清澈透(tou)明，懸浮(fu)物(wu)應離(li)心去除。

7.樣(yang)品(pin)(pin)保存(cun)：樣(yang)品(pin)(pin)收集后若在1周內進行檢(jian)(jian)(jian)測的可保存(cun)于(yu)4℃，若不(bu)能及時(shi)檢(jian)(jian)(jian)測，請(qing)按一次使用量分裝(zhuang)，凍(dong)存(cun)于(yu)-20℃（1個(ge)月內檢(jian)(jian)(jian)測），或-80℃（6個(ge)月內檢(jian)(jian)(jian)測），避免反復凍(dong)融，標本溶血(xue)會影響后檢(jian)(jian)(jian)測結果，因此溶血(xue)標本不(bu)宜進行此項檢(jian)(jian)(jian)測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和(he)溫(wen)度進行(xing)溫(wen)育以保證準確結(jie)果。所有(you)試劑(ji)都必須在使用(yong)前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使用(yong)后立即冷藏保存試劑(ji)。

2.洗板(ban)不(bu)正確可以導致不(bu)準確的結果。在加(jia)入底物(wu)前確保盡(jin)量吸干孔內(nei)液體。溫育過程中不(bu)要讓微(wei)孔干燥掉。

3.消除板底殘留的液體和手指(zhi)印(yin)，否則影響OD值(zhi)。

4.底物顯色液應呈無色或(huo)很淺(qian)的顏(yan)色，已經變藍(lan)的底物液不能(neng)使用。

5.避免(mian)試劑(ji)和標本(ben)的交叉(cha)污(wu)染以免(mian)造成錯誤結果。

6.在(zai)儲存和溫(wen)育時(shi)避免強光直(zhi)接照射。

7.平(ping)衡至室溫(wen)后(hou)再打開(kai)密封袋以防水滴(di)凝聚在冷板條上。

8.任何(he)反(fan)應試劑(ji)不能(neng)接觸漂白溶(rong)劑(ji)或漂白溶(rong)劑(ji)所(suo)散發的(de)強烈氣體。任何(he)漂白成分都會(hui)破壞試劑(ji)盒中(zhong)反(fan)應試劑(ji)的(de)生(sheng)物活性。

9.不能使用過期產(chan)品。

10.如果可能傳(chuan)播疾病(bing)，所(suo)有的樣品(pin)(pin)都應管理(li)好，按照規定的程序處理(li)樣品(pin)(pin)和檢測裝置。

操作步驟：

1．從室(shi)溫平衡60min后的(de)鋁箔袋中取出(chu)所需(xu)板(ban)條，剩余板(ban)條用自封袋密封放回(hui)4℃。

2．設置(zhi)標(biao)準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)準品孔(kong)各加不同濃(nong)度的標(biao)準品50μL。

3．樣本(ben)孔(kong)中a加(jia)入待測樣本(ben)50μL；空白孔(kong)不(bu)加(jia)。

4．除(chu)空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過氧化(hua)物酶(mei)（HRP）標記的檢測抗(kang)體100μL，用封板膜封住(zhu)反應(ying)孔(kong)，37℃水浴鍋(guo)或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5．棄去(qu)液(ye)體，吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍干，每(mei)孔加滿洗(xi)滌(di)液(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗(xi)滌(di)液(ye)，吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍干，如此重復洗(xi)板5次（也(ye)可(ke)用(yong)洗(xi)板機洗(xi)板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避(bi)光(guang)孵育15min。

7．每孔加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測定(ding)各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制(zhi)(zhi)標準曲線：在Excel工(gong)作(zuo)表中，以(yi)標準品(pin)濃度作(zuo)橫坐(zuo)標，對(dui)應OD值作(zuo)縱坐(zuo)標，繪制(zhi)(zhi)出標準品(pin)線性(xing)回(hui)歸(gui)曲線，按曲線方(fang)程計算各樣(yang)本濃度值。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢(jian)測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：低檢測濃度小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它(ta)可溶性結構類似物交叉(cha)反(fan)應。

4.重復(fu)性：板(ban)內變異系(xi)數小(xiao)于(yu)10% ，板(ban)間變異系(xi)數小(xiao)于(yu)15% 。

豬左右決定因子1(LEFTY1)試劑盒技術小提示：

1.當混合或重溶蛋白溶液(ye)時，盡量避免起沫。

2.為了避免交叉感染，配置(zhi)不(bu)(bu)同(tong)(tong)濃度標準(zhun)品、上樣、加(jia)不(bu)(bu)同(tong)(tong)試(shi)劑都需要更換槍(qiang)頭。另外(wai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)試(shi)劑請(qing)分別使用不(bu)(bu)同(tong)(tong)的(de)移(yi)液槽。

3.每(mei)次(ci)孵(fu)育時，請(qing)正確(que)使用封板膠(jiao)可保證結(jie)果的準確(que)性。

4.混合后(hou)的顯色底物在上板(ban)前(qian)應(ying)為(wei)無色，請避光保存(cun)；假如微孔(kong)板(ban)后(hou)，將由(you)物色變成不同(tong)深度的藍色。

5.液(ye)上(shang)板順序應(ying)同(tong)顯色(se)底物上(shang)板順序一致；加(jia)入(ru)終止液(ye)后，孔(kong)內(nei)顏色(se)由(you)藍變黃；若孔(kong)內(nei)有綠(lv)色(se)，則表明(ming)孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)未混(hun)勻(yun)；請充分(fen)混(hun)合。

說明：

1.由于現有(you)條件(jian)及科學技術水平尚(shang)不能對所(suo)有(you)供(gong)貨(huo)商提供(gong)的所(suo)有(you)原料(liao)進行(xing)全(quan)面的鑒定與分析，本(ben)產(chan)品(pin)可能存在一定的質量技術風險。

2.實驗(yan)結果與試劑的(de)有效性、實驗(yan)者的(de)相關操(cao)作(zuo)以及當(dang)時(shi)的(de)實驗(yan)環境密切(qie)相關，請(qing)務必準備充足的(de)標本備份(fen)。

3.不同批(pi)次的同一產品(pin)可(ke)能會有少(shao)許(xu)差(cha)別，如：檢測限、靈(ling)敏(min)度以及顯(xian)色時間(jian)等，請依據試劑盒內說(shuo)明書進行實驗操作(zuo)，網站電子版說(shuo)明書僅作(zuo)參考。

4.只有(you)全(quan)部使用(yong)本試劑(ji)盒配(pei)套試劑(ji)才能保證檢(jian)測(ce)效果，不能混用(yong)其他制(zhi)造商的(de)產(chan)品。只有(you)嚴(yan)格遵守(shou)本試劑(ji)盒的(de)實(shi)驗說明才會得到(dao)的(de)檢(jian)測(ce)結果。