大鼠L選(xuan)擇素(L-Selectin)試劑盒

本試劑(ji)盒僅供(gong)體外研究使用，不用于臨床診(zhen)斷

本試劑盒用(yong)于(yu)體(ti)外定(ding)量檢測血清、血漿、組織勻(yun)漿及相關(guan)液體(ti)樣本中大鼠L選擇素(su)(L-Selectin)的含量。

有(you)效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑(ji)盒組成(cheng)：

備注：

1.（96T/48T）打開(kai)包裝(zhuang)后請及時(shi)檢查(cha)所有物品是否(fou)齊全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正(zheng)常標(biao)本(ben)(ben)(ben)檢驗(yan)，標(biao)本(ben)(ben)(ben)的(de)(de)正(zheng)常濃(nong)度值均在試劑(ji)盒提供的(de)(de)檢測范圍(wei)內，實(shi)驗(yan)過程中直(zhi)接(jie)取(qu)50μL樣本(ben)(ben)(ben)上(shang)樣即可。當(dang)有部分(fen)樣本(ben)(ben)(ben)值超過大標(biao)準品濃(nong)度時，可用樣本(ben)(ben)(ben)稀釋(shi)液將標(biao)本(ben)(ben)(ben)進(jin)行適當(dang)稀釋(shi)后再進(jin)行實(shi)驗(yan)。

檢測前準備工作：

1.請提(ti)前20分鐘從冰(bing)箱(xiang)中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中取(qu)出的濃縮洗(xi)(xi)滌液(ye)可能有結晶，屬(shu)于正(zheng)常現(xian)象(xiang)；放置(zhi)室溫(wen)，輕搖均勻，待結晶溶解(jie)后再配置(zhi)洗(xi)(xi)滌液(ye)。可將20ml濃縮洗(xi)(xi)滌液(ye)用蒸(zheng)餾水(shui)或(huo)去離子水(shui)稀釋(shi)配置(zhi)成400ml工作濃度的洗(xi)(xi)滌液(ye)，未用完的放回(hui)4℃

3.20×洗(xi)滌緩沖液的稀釋：蒸餾(liu)水按1：20稀釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌緩沖液加19份(fen)蒸餾(liu)水。

實驗原理：

大鼠L選擇素(L-Selectin)試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠L選擇素(L-Selectin)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠L選擇素(L-Selectin)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

實(shi)驗所需(xu)自備(bei)試(shi)驗器材(cai)：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或去離子水(shui)

樣(yang)本處理及要求：

1.血清：將收集于(yu)血清分離管(guan)的全血標(biao)本在室(shi)溫放置2小時或(huo)4℃過(guo)夜(ye)，然后(hou)1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或(huo)將上清置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

2.血漿：用(yong)EDTA或(huo)肝素作為抗(kang)凝(ning)劑采集標本，并(bing)將標本在采集后(hou)的30分鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將上(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

3.組(zu)織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織，去除殘留(liu)血液（勻漿中裂解(jie)的(de)紅細胞會(hui)影響測量(liang)結果(guo)），稱重后(hou)將組(zu)織剪(jian)碎(sui)(sui)。將剪(jian)碎(sui)(sui)的(de)組(zu)織與對(dui)應體(ti)積的(de)PBS（一般(ban)按1:9的(de)重量(liang)體(ti)積比，比如1g的(de)組(zu)織樣品對(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實驗需(xu)要適當調(diao)整，并做好(hao)記(ji)錄。推(tui)薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋白酶抑制劑）加(jia)入(ru)玻璃勻漿器中，于冰上充分(fen)研(yan)磨。為了進一步裂解(jie)組(zu)織細胞，可以對(dui)勻漿液進行超聲破碎(sui)(sui)，或反復(fu)凍(dong)融(rong)。后(hou)將勻漿液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4.細胞培(pei)養物上清(qing)：請1000×g離(li)心20分(fen)鐘，取上清(qing)即可檢測(ce)，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復(fu)凍融。

5.其它生物(wu)標本(ben)：1000×g離心(xin)20分鐘，取上清(qing)即可檢(jian)測。

6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離(li)心去除。

7.樣(yang)品保存：樣(yang)品收(shou)集后(hou)若在1周內進行(xing)(xing)檢(jian)測(ce)的可保存于(yu)(yu)4℃，若不(bu)能及時檢(jian)測(ce)，請(qing)按一(yi)次(ci)使用量分(fen)裝，凍存于(yu)(yu)-20℃（1個(ge)月內檢(jian)測(ce)），或-80℃（6個(ge)月內檢(jian)測(ce)），避免反(fan)復凍融，標本溶血(xue)會影響后(hou)檢(jian)測(ce)結果，因(yin)此(ci)溶血(xue)標本不(bu)宜進行(xing)(xing)此(ci)項檢(jian)測(ce)。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間(jian)和溫(wen)度進行溫(wen)育(yu)以保證準(zhun)確(que)結果。所(suo)有試劑都(dou)必須(xu)在使(shi)用(yong)前達到(dao)室溫(wen)20-25℃。使(shi)用(yong)后立(li)即冷藏(zang)保存試劑。

2.洗(xi)板不(bu)正確可以(yi)導致不(bu)準確的結果(guo)。在加入(ru)底(di)物前確保盡量吸(xi)干孔內液體。溫育(yu)過程中不(bu)要讓微孔干燥掉(diao)。

3.消除板底殘(can)留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.底(di)物(wu)顯色(se)液應呈無色(se)或(huo)很淺的顏色(se)，已經變藍的底(di)物(wu)液不能(neng)使用(yong)。

5.避免(mian)試(shi)劑和標本(ben)的交叉污染以免(mian)造成錯誤結果。

6.在儲(chu)存和溫(wen)育時(shi)避免(mian)強光(guang)直接照射。

7.平衡至室溫后再打開密(mi)封袋以防水滴凝聚在冷板條上(shang)。

8.任何(he)反(fan)應(ying)試劑(ji)不(bu)能(neng)接觸(chu)漂(piao)白溶劑(ji)或漂(piao)白溶劑(ji)所散發的強(qiang)烈氣體。任何(he)漂(piao)白成分都(dou)會(hui)破壞試劑(ji)盒中反(fan)應(ying)試劑(ji)的生物活性。

9.不能(neng)使用過期產品。

10.如果可(ke)能(neng)傳(chuan)播疾病(bing)，所有(you)的(de)(de)樣品都應(ying)管理好，按照規(gui)定(ding)的(de)(de)程序處(chu)理樣品和檢(jian)測裝置(zhi)。

操(cao)作步(bu)驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中(zhong)取出所需(xu)板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2．設置(zhi)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)孔和樣(yang)本孔，標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)孔各加不(bu)同濃(nong)度的標(biao)(biao)(biao)準(zhun)品(pin)50μL。

3．樣本(ben)孔中(zhong)a加入待測樣本(ben)50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，標(biao)(biao)準品孔和(he)樣本孔中每孔加入辣根過(guo)氧(yang)化物酶(mei)（HRP）標(biao)(biao)記(ji)的檢測抗體100μL，用封板膜封住反(fan)應(ying)孔，37℃水浴鍋(guo)或恒溫箱溫育60min。

5．棄去(qu)液體，吸水紙上(shang)拍干，每(mei)孔(kong)加滿洗(xi)(xi)滌(di)液（350μL），靜(jing)置1min，甩去(qu)洗(xi)(xi)滌(di)液，吸水紙上(shang)拍干，如此重復洗(xi)(xi)板(ban)(ban)5次（也可(ke)用洗(xi)(xi)板(ban)(ban)機洗(xi)(xi)板(ban)(ban)）。

6．每孔加入(ru)底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7．每孔加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波(bo)長(chang)處測定各(ge)孔的OD值。

實驗結果計算：

繪(hui)制標準曲(qu)線(xian)：在Excel工作表中，以標準品(pin)(pin)濃度作橫坐標，對應OD值(zhi)作縱(zong)坐標，繪(hui)制出(chu)標準品(pin)(pin)線(xian)性(xing)回歸曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方程計(ji)算各(ge)樣本濃度值(zhi)。

（此(ci)圖僅供參考(kao)）

性(xing)能：

1. 檢測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：低檢(jian)測濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結構類似(si)物交叉反應。

4.重(zhong)復(fu)性：板內變(bian)異系數(shu)小(xiao)于10% ，板間變(bian)異系數(shu)小(xiao)于15% 。

技(ji)術(shu)小提示：

1.當混合(he)或(huo)重溶(rong)蛋白(bai)溶(rong)液(ye)時，盡(jin)量避免(mian)起沫。

2.大鼠L選擇素(L-Selectin)試劑盒為了避免交叉感染，配置不同濃度標準品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。

3.每次孵育(yu)時，請正確使用封板膠可保(bao)證結果的準確性。

4.混(hun)合(he)后的顯色底物在上(shang)板前應(ying)為無色，請(qing)避光(guang)保(bao)存；假如(ru)微孔板后，將由物色變成不同深度的藍色。

5.終止液上板(ban)順(shun)序應同顯色(se)底(di)物上板(ban)順(shun)序一致(zhi)；加(jia)入終止液后，孔內顏色(se)由藍變(bian)黃；若孔內有綠色(se)，則表明孔內液體(ti)未混勻；請(qing)充(chong)分混合。

說明：

1.由于(yu)現有(you)條件及科(ke)學(xue)技術水平尚不能對(dui)所有(you)供貨商(shang)提供的所有(you)原料進行全面的鑒(jian)定(ding)(ding)與分析，本(ben)產品可(ke)能存在(zai)一定(ding)(ding)的質量(liang)技術風險。

2.的(de)實(shi)驗(yan)結果與試劑的(de)有效性、實(shi)驗(yan)者的(de)相關操作以(yi)及當時的(de)實(shi)驗(yan)環境密切相關，請務(wu)必準備充(chong)足的(de)標本備份。

3.不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢(jian)測限、靈敏度以及(ji)顯色時間等，請(qing)依據試劑盒內說明(ming)書(shu)進(jin)行(xing)實(shi)驗操作，網站(zhan)電(dian)子(zi)版說明(ming)書(shu)僅作參考。

4.只有(you)全部使用本試(shi)劑(ji)盒配套試(shi)劑(ji)才能保證檢(jian)測(ce)效果(guo)，不能混用其他制造商的(de)產品。只有(you)嚴(yan)格(ge)遵守本試(shi)劑(ji)盒的(de)實驗說明才會得到的(de)檢(jian)測(ce)結果(guo)。