小鼠Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)試劑盒

本試劑盒僅供體外研(yan)究使(shi)用，不用于臨床診(zhen)斷

本試(shi)劑(ji)盒用(yong)于(yu)體外定量(liang)檢測血清、血漿、組織勻漿及(ji)相關液體樣本中(zhong)小(xiao)鼠Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)的含量(liang)。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所(suo)有(you)物(wu)品是否齊全。

2. 標準品濃度(du)依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經(jing)過(guo)大量正常標(biao)本檢(jian)驗(yan)，標(biao)本的(de)正常濃(nong)度值均(jun)在試(shi)劑(ji)盒提供的(de)檢(jian)測范(fan)圍內(nei)，實驗(yan)過(guo)程中直接(jie)取50μL樣本上樣即可。當(dang)有部分樣本值超過(guo)標(biao)準品濃(nong)度時，可用樣本稀釋液(ye)將標(biao)本進行適當(dang)稀釋后再進行實驗(yan)。

檢測前準備工作：

?

1.請提(ti)前20分(fen)鐘從(cong)冰箱(xiang)中取出(chu)試劑(ji)盒，平衡(heng)至室溫。

2.從冰箱中取(qu)出的(de)濃(nong)縮洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)可能(neng)有結(jie)晶，屬于正常現象(xiang)；放置(zhi)室溫，輕搖均勻，待結(jie)晶溶解(jie)后再配置(zhi)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)。可將20ml濃(nong)縮洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)用(yong)蒸餾水或去離(li)子(zi)水稀釋配置(zhi)成400ml工(gong)作濃(nong)度的(de)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)，未(wei)用(yong)完的(de)放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的(de)稀釋：蒸餾水(shui)按(an)1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加(jia)19份蒸餾水(shui)。

實驗原理：

小鼠Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)試劑盒采用(yong)(yong)雙(shuang)抗體一步夾心法(fa)酶(mei)聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yu)先包(bao)被小(xiao)鼠Mg2+/Mn2+依賴(lai)性蛋(dan)白磷(lin)(lin)酸(suan)酶(mei)1A(PPM1A)捕獲抗體的(de)(de)(de)包(bao)被微孔中(zhong)，依次加入標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)(de)(de)檢測(ce)抗體，經過溫(wen)育并洗(xi)滌。用(yong)(yong)底(di)物TMB顯(xian)色(se)，TMB在(zai)過氧化物酶(mei)的(de)(de)(de)催化下轉化成藍色(se)，并在(zai)酸(suan)的(de)(de)(de)作用(yong)(yong)下轉化成的(de)(de)(de)黃(huang)色(se)。顏色(se)的(de)(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)小(xiao)鼠Mg2+/Mn2+依賴(lai)性蛋(dan)白磷(lin)(lin)酸(suan)酶(mei)1A(PPM1A)呈(cheng)正相關。用(yong)(yong)酶(mei)標(biao)儀在(zai)450nm 波長下測(ce)定吸光度（OD 值），計算(suan)樣(yang)品(pin)濃(nong)度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精(jing)度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水或(huo)去(qu)離(li)子水

樣本處理及要求：

1.血清：將(jiang)收集于血清分離(li)管的全血標本(ben)在室溫放置2小時或4℃過夜(ye)，然后1000×g離(li)心(xin)20 分鐘，取(qu)上清即可，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免(mian)反復凍融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝(gan)素作為抗凝(ning)劑采集標本(ben)，并(bing)將(jiang)標本(ben)在采集后的(de)30分鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清即(ji)可檢(jian)測，或(huo)將(jiang)上(shang)清置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免(mian)反(fan)復凍融。

3.組織(zhi)(zhi)勻(yun)漿(jiang)(jiang)：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織(zhi)(zhi)，去除(chu)殘留(liu)血液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)中裂解的(de)紅細胞會影(ying)響測(ce)(ce)量(liang)結果），稱重后將(jiang)組織(zhi)(zhi)剪碎(sui)(sui)。將(jiang)剪碎(sui)(sui)的(de)組織(zhi)(zhi)與對應(ying)體積的(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)重量(liang)體積比(bi)，比(bi)如1g的(de)組織(zhi)(zhi)樣品對應(ying)9mL的(de)PBS，具體體積可(ke)根(gen)據實(shi)驗需(xu)要適當調整，并做(zuo)好記錄。推薦在PBS中加入蛋(dan)白酶抑制劑(ji)）加入玻(bo)璃(li)勻(yun)漿(jiang)(jiang)器中，于(yu)冰上(shang)充分(fen)研磨。為(wei)了進一(yi)步裂解組織(zhi)(zhi)細胞，可(ke)以(yi)對勻(yun)漿(jiang)(jiang)液進行超聲(sheng)破碎(sui)(sui)，或反復凍融。將(jiang)勻(yun)漿(jiang)(jiang)液于(yu)5000×g離心5~10分(fen)鐘，取(qu)上(shang)清(qing)檢(jian)測(ce)(ce)。

4.細胞培養(yang)物上清(qing)：請1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢(jian)測(ce)，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

5.其它生物標本(ben)：1000×g離心(xin)20分鐘，取上清即可檢(jian)測。

6.樣(yang)品外觀：樣(yang)品應(ying)清澈(che)透明(ming)，懸浮物應(ying)離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若(ruo)在1周內(nei)進行檢測(ce)(ce)的可保存于4℃，若(ruo)不能及時檢測(ce)(ce)，請按一(yi)次使用量分裝(zhuang)，凍存于-20℃（1個(ge)月(yue)內(nei)檢測(ce)(ce)），或-80℃（6個(ge)月(yue)內(nei)檢測(ce)(ce)），避免反復(fu)凍融，標本(ben)溶血會影(ying)響檢測(ce)(ce)結果，因此(ci)溶血標本(ben)不宜(yi)進行此(ci)項檢測(ce)(ce)。

注意事項：

1.嚴格按(an)照規定的(de)時間和溫(wen)(wen)度進行溫(wen)(wen)育(yu)以保證準確結果。所有試(shi)劑都(dou)必須在使用(yong)前達到室溫(wen)(wen)20-25℃。使用(yong)后立(li)即冷藏保存試(shi)劑。

2.洗板不正(zheng)確可以導致(zhi)不準(zhun)確的結果。在(zai)加入底物(wu)前確保盡量(liang)吸干孔(kong)內(nei)液體(ti)。溫育過程中不要讓(rang)微孔(kong)干燥掉(diao)。

3.消除板底殘留(liu)的(de)液體和手指印，否則影響OD值。

4.底物(wu)顯(xian)色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物(wu)液不能使用。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6.在儲存(cun)和溫育時避免(mian)強光直接(jie)照射。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防(fang)水滴凝聚(ju)在(zai)冷板條上。

8.任何反應(ying)試(shi)劑(ji)不能接觸漂(piao)白(bai)溶劑(ji)或漂(piao)白(bai)溶劑(ji)所(suo)散(san)發的(de)強烈氣體。任何漂(piao)白(bai)成(cheng)分都會破壞試(shi)劑(ji)盒中(zhong)反應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物活性。

9.不能(neng)使用過期產品(pin)。

10.如(ru)果可能傳(chuan)播疾(ji)病，所有(you)的樣品都(dou)應管理好，按照(zhao)規定的程序處理樣品和檢測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的(de)鋁箔袋(dai)中(zhong)取出所(suo)需板(ban)條，剩余(yu)板(ban)條用自封袋(dai)密(mi)封放回4℃。

2．設置標準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標準品孔(kong)各加不(bu)同濃度的(de)標準品50μL。

3．樣本孔中a加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4．除空白(bai)孔外，標準品孔和樣本(ben)孔中每孔加入(ru)辣根過(guo)氧化物酶(mei)（HRP）標記的檢(jian)測抗體100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反(fan)應孔，37℃水浴(yu)鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄(qi)去液(ye)體，吸(xi)(xi)水紙上(shang)拍干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩去洗(xi)滌液(ye)，吸(xi)(xi)水紙上(shang)拍干(gan)，如此重復洗(xi)板5次（也(ye)可(ke)用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6．每(mei)孔加入底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵育(yu)15min。

7．每孔(kong)加入終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在(zai)450nm波長處測定各孔(kong)的OD值。

實驗結果計算：

繪(hui)(hui)制標(biao)準曲(qu)線(xian)：在Excel工作表中，以(yi)標(biao)準品濃(nong)度作橫坐標(biao)，對應OD值作縱坐標(biao)，繪(hui)(hui)制出標(biao)準品線(xian)性回歸曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方程計算各樣(yang)本濃(nong)度值。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢(jian)測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢測濃度小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異(yi)性(xing)：不與其它可溶性(xing)結構類(lei)似物交叉反(fan)應。

4.重復性：板內變異(yi)系(xi)數(shu)小于10% ，板間變異(yi)系(xi)數(shu)小于15% 。

技術小提示：

1.當混合(he)或重(zhong)溶蛋白溶液時，盡量避免(mian)起沫。

2.小鼠Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)試劑盒為了避免交叉感染，配置不(bu)同濃度標準品、上(shang)樣、加(jia)不(bu)同試劑都需要更換槍(qiang)頭。另外不(bu)同試劑請分別使用不(bu)同的移液槽(cao)。

3.每次(ci)孵育時，請正確使用封板膠可保證(zheng)結果(guo)的(de)準(zhun)確性。

4.混合后的顯色(se)(se)底物在上板(ban)(ban)前應為無色(se)(se)，請避光(guang)保存；假如(ru)微孔(kong)板(ban)(ban)后，將由物色(se)(se)變成不同深度的藍(lan)色(se)(se)。

5.終止液上(shang)板(ban)順(shun)序(xu)應同顯色(se)(se)底物上(shang)板(ban)順(shun)序(xu)一致；加入(ru)終止液后，孔(kong)內(nei)顏色(se)(se)由藍變(bian)黃；若(ruo)孔(kong)內(nei)有綠色(se)(se)，則表明孔(kong)內(nei)液體未混勻；請充分(fen)混合。

說明：

1.由于現有條件及科(ke)學技術水平尚不能對(dui)所有供(gong)貨商提供(gong)的所有原料進行(xing)全面的鑒定(ding)與(yu)分析，本產(chan)品(pin)可能存在一定(ding)的質量技術風險。

2.實(shi)驗(yan)結(jie)果與試劑的(de)有效性、實(shi)驗(yan)者的(de)相(xiang)關操作以及當時的(de)實(shi)驗(yan)環境密(mi)切(qie)相(xiang)關，請務必(bi)準備(bei)充足的(de)標本備(bei)份(fen)。

3.不同(tong)批(pi)次的(de)同(tong)一(yi)產品可能會有少許(xu)差別，如(ru)：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依(yi)據試劑盒內(nei)說(shuo)明(ming)書進行實(shi)驗操(cao)作，網站電子版說(shuo)明(ming)書僅(jin)作參(can)考。

4.只有全部使(shi)用本(ben)試(shi)劑盒配套試(shi)劑才能保證檢(jian)測效果，不(bu)能混(hun)用其他制造商的產品(pin)。只有嚴格遵(zun)守本(ben)試(shi)劑盒的實驗說明才會得到的檢(jian)測結果。