人ⅡA組磷脂酶A2(PLA2G2A)試劑盒

本(ben)試劑(ji)盒僅供體外研究使用(yong)，不(bu)用(yong)于臨床診斷

本試劑盒用(yong)于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人ⅡA組磷脂酶A2(PLA2G2A)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全(quan)。

2. 標準品濃(nong)度依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經(jing)過大(da)量正常標(biao)本檢驗(yan)，標(biao)本的正常濃(nong)度值均在(zai)試劑盒提供的檢測范圍內，實驗(yan)過程中(zhong)直接取50μL樣(yang)本上樣(yang)即(ji)可(ke)。當(dang)有(you)部分樣(yang)本值超過大(da)標(biao)準品濃(nong)度時，可(ke)用(yong)樣(yang)本稀釋液將標(biao)本進行(xing)適(shi)當(dang)稀釋后(hou)再進行(xing)實驗(yan)。

檢測前準備工作：

1.請提前20分鐘從冰箱(xiang)中取出試(shi)劑盒，平衡至(zhi)室溫。

2.從冰箱中(zhong)取出的(de)(de)濃縮洗(xi)滌(di)(di)液(ye)可能(neng)有結(jie)(jie)晶(jing)，屬(shu)于正常(chang)現象；放置室溫，輕搖均(jun)勻，待結(jie)(jie)晶(jing)溶解后再配置洗(xi)滌(di)(di)液(ye)。可將20ml濃縮洗(xi)滌(di)(di)液(ye)用蒸餾水或去(qu)離子水稀釋配置成400ml工(gong)作濃度(du)的(de)(de)洗(xi)滌(di)(di)液(ye)，未用完的(de)(de)放回4℃

3.20×洗滌(di)緩沖液(ye)的稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)(liu)水按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份20×洗滌(di)緩沖液(ye)加19份蒸(zheng)餾(liu)(liu)水。

實驗原理：

人ⅡA組磷脂酶A2(PLA2G2A)試劑盒采用(yong)(yong)(yong)(yong)雙(shuang)抗體一(yi)步夾心法酶(mei)(mei)聯免疫吸附試(shi)驗(yan)（ELISA）。往(wang)預先(xian)包被人ⅡA組(zu)磷脂酶(mei)(mei)A2(PLA2G2A)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入(ru)標(biao)本、標(biao)準品、HRP標(biao)記的檢測(ce)抗體，經過溫育并(bing)洗(xi)滌。用(yong)(yong)(yong)(yong)底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧(yang)化物酶(mei)(mei)的催化下轉化成(cheng)藍色(se)，并(bing)在酸(suan)的作用(yong)(yong)(yong)(yong)下轉化成(cheng)終的黃色(se)。顏色(se)的深(shen)淺和樣(yang)(yang)品中的人ⅡA組(zu)磷脂酶(mei)(mei)A2(PLA2G2A)呈正相關。用(yong)(yong)(yong)(yong)酶(mei)(mei)標(biao)儀在450nm 波長下測(ce)定(ding)吸光度（OD 值），計算樣(yang)(yang)品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精(jing)度加樣器及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或(huo)去離子(zi)水(shui)

樣本處理及要求：

1.血(xue)清(qing)：將收(shou)集于血(xue)清(qing)分離管的全血(xue)標本在室溫(wen)放置2小(xiao)時或(huo)4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取(qu)上清(qing)即可(ke)，或(huo)將上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融(rong)。

2.血漿：用EDTA或肝素作為(wei)抗凝劑采集(ji)標本，并將標本在采集(ji)后的(de)30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。

3.組織(zhi)(zhi)勻漿：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)(zhi)，去除殘留血液(ye)（勻漿中裂(lie)解的紅細胞(bao)會影響(xiang)測量結果），稱重(zhong)后(hou)將(jiang)組織(zhi)(zhi)剪碎(sui)。將(jiang)剪碎(sui)的組織(zhi)(zhi)與對應體積的PBS（一般按1:9的重(zhong)量體積比，比如1g的組織(zhi)(zhi)樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要(yao)適(shi)當調整，并做好記錄。推(tui)薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰(bing)上充分(fen)研(yan)磨。為了進一步裂(lie)解組織(zhi)(zhi)細胞(bao)，可以對勻漿液(ye)進行超聲破碎(sui)，或反復(fu)凍融。后(hou)將(jiang)勻漿液(ye)于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4.細胞培養物上(shang)(shang)清(qing)：請1000×g離心20分(fen)鐘，取上(shang)(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將(jiang)上(shang)(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保(bao)存，但應避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong)。

5.其它生(sheng)物標本(ben)：1000×g離心20分鐘，取(qu)上清即可檢測。

6.樣品(pin)外觀：樣品(pin)應清澈(che)透明，懸浮物應離心去(qu)除。

7.樣(yang)品保(bao)(bao)存：樣(yang)品收集(ji)后若在1周內(nei)進(jin)行(xing)檢(jian)測的可保(bao)(bao)存于4℃，若不能及時檢(jian)測，請按一次使用量(liang)分(fen)裝，凍存于-20℃（1個(ge)月(yue)內(nei)檢(jian)測），或-80℃（6個(ge)月(yue)內(nei)檢(jian)測），避免反復凍融，標本(ben)溶血會影響后檢(jian)測結果，因此(ci)溶血標本(ben)不宜進(jin)行(xing)此(ci)項檢(jian)測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育(yu)以(yi)保證(zheng)準確結果(guo)。所有試劑都必須在使(shi)用前(qian)達到室溫20-25℃。使(shi)用后立即冷藏保存試劑。

2.洗(xi)板(ban)不(bu)(bu)正確(que)可以導致不(bu)(bu)準確(que)的結果。在加(jia)入底物前確(que)保盡(jin)量吸干(gan)孔(kong)內液體(ti)。溫育過程(cheng)中不(bu)(bu)要(yao)讓微孔(kong)干(gan)燥(zao)掉。

3.消(xiao)除板底殘(can)留(liu)的液體和手指印(yin)，否則(ze)影響OD值。

4.底物顯色(se)液應呈無色(se)或很淺的顏色(se)，已經(jing)變藍的底物液不能(neng)使用。

5.避免(mian)試劑和標(biao)本的交叉污(wu)染以免(mian)造成錯誤結果。

6.在儲存和溫育時避免(mian)強(qiang)光直接照射。

7.平(ping)衡至室(shi)溫后再打開密封(feng)袋(dai)以防水滴凝聚在冷板條上。

8.任(ren)何(he)反(fan)應試劑(ji)不能接觸漂白溶劑(ji)或漂白溶劑(ji)所散(san)發(fa)的強烈氣體(ti)。任(ren)何(he)漂白成分都會破壞試劑(ji)盒中反(fan)應試劑(ji)的生物活性。

9.不能使用過期產品(pin)。

10.如(ru)果(guo)可能傳播疾病，所有的樣品都(dou)應管理好，按照(zhao)規定的程序處(chu)理樣品和檢(jian)測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡(heng)60min后的(de)鋁箔袋(dai)(dai)中(zhong)取出所需板條，剩余板條用自封(feng)袋(dai)(dai)密封(feng)放回(hui)4℃。

2．設(she)置(zhi)標(biao)準(zhun)(zhun)品孔和樣本孔，標(biao)準(zhun)(zhun)品孔各(ge)加不(bu)同(tong)濃度的標(biao)準(zhun)(zhun)品50μL。

3．樣本孔中a加入(ru)待測樣本50μL；空白(bai)孔不(bu)加。

4．除空白孔(kong)外，標(biao)準(zhun)品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過氧化物酶（HRP）標(biao)記的檢(jian)測抗體100μL，用(yong)封(feng)板膜(mo)封(feng)住反(fan)應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒溫箱(xiang)溫育60min。

5．棄去(qu)液(ye)(ye)體，吸(xi)水(shui)紙上拍干，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗(xi)滌液(ye)(ye)，吸(xi)水(shui)紙上拍干，如此(ci)重復(fu)洗(xi)板5次（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6．每孔加入(ru)底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵育(yu)15min。

7．每孔(kong)加(jia)入終止(zhi)液50μL，15min內，在(zai)450nm波(bo)長處測定各孔(kong)的OD值。

實驗結果計算：

繪制(zhi)標(biao)準曲(qu)線：在Excel工作(zuo)表中，以標(biao)準品濃(nong)度作(zuo)橫坐標(biao)，對(dui)應OD值(zhi)作(zuo)縱坐標(biao)，繪制(zhi)出標(biao)準品線性回歸曲(qu)線，按曲(qu)線方程計算各樣本濃(nong)度值(zhi)。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢測范圍(wei)：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈(ling)敏度：低檢(jian)測濃(nong)度小于1.0 pg/mL。

3.特異性(xing)(xing)：不(bu)與其它可溶性(xing)(xing)結構類似(si)物交叉(cha)反應(ying)。

4.重復性(xing)：板(ban)內變(bian)異(yi)系數(shu)小于(yu)10% ，板(ban)間變(bian)異(yi)系數(shu)小于(yu)15% 。

技術小提示：

1.當(dang)混(hun)合(he)或重溶蛋白溶液時(shi)，盡量避免起沫。

2.人ⅡA組磷脂酶A2(PLA2G2A)試劑盒為了(le)避免交叉(cha)感染，配置(zhi)不(bu)(bu)同濃度標準品、上樣、加不(bu)(bu)同試劑都需要更換槍頭。另外不(bu)(bu)同試劑請分別使用不(bu)(bu)同的移液槽。

3.每次孵育時(shi)，請正(zheng)確使用(yong)封板膠可保(bao)證結果的準確性。

4.混合后的(de)顯色底物(wu)在上板前應(ying)為無色，請避光保(bao)存；假如微(wei)孔(kong)板后，將由(you)物(wu)色變(bian)成不同深(shen)度(du)的(de)藍色。

5.終止液(ye)上(shang)板順(shun)序(xu)應(ying)同顯色底(di)物上(shang)板順(shun)序(xu)一致(zhi)；加入終止液(ye)后，孔內(nei)顏(yan)色由藍變黃；若孔內(nei)有綠(lv)色，則表明(ming)孔內(nei)液(ye)體未混勻；請充分(fen)混合(he)。

說明：

1.由于現(xian)有(you)(you)(you)條(tiao)件及(ji)科學技術水平尚(shang)不能(neng)對所(suo)有(you)(you)(you)供(gong)貨商(shang)提(ti)供(gong)的所(suo)有(you)(you)(you)原料進行全面的鑒定與分析，本產品(pin)可能(neng)存(cun)在一定的質量技術風險(xian)。

2.實驗結(jie)果與試劑的有效(xiao)性(xing)、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請(qing)務必準備充足的標本備份。

3.不同批次的同一(yi)產品(pin)可能會有少許差別，如：檢測限、靈(ling)敏度以(yi)及顯(xian)色時(shi)間(jian)等，請依據試劑盒內說(shuo)明(ming)書進行實驗操作，網(wang)站電子(zi)版說(shuo)明(ming)書僅作參考(kao)。

4.只有全部使(shi)用本(ben)試劑(ji)(ji)盒(he)配套試劑(ji)(ji)才能(neng)保(bao)證檢測效(xiao)果，不(bu)能(neng)混用其他制造(zao)商(shang)的產品(pin)。只有嚴(yan)格遵(zun)守本(ben)試劑(ji)(ji)盒(he)的實驗說明(ming)才會得到的檢測結果。