大鼠CREB結合蛋白(CREBBP)試劑盒

本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床(chuang)診斷

本試劑盒用于體外定量檢測(ce)血(xue)清、血(xue)漿、組(zu)織勻漿及(ji)相關液體樣本中大鼠CREB結合蛋白(CREBBP)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及(ji)時檢(jian)查所有(you)物品是否齊(qi)全。

2. 標準品濃度(du)依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過(guo)大(da)量正(zheng)常標(biao)本(ben)檢驗，標(biao)本(ben)的(de)正(zheng)常濃度(du)值均在試劑盒提供的(de)檢測(ce)范圍內，實驗過(guo)程中直接取50μL樣本(ben)上樣即可。當有部分樣本(ben)值超過(guo)標(biao)準品濃度(du)時(shi)，可用樣本(ben)稀釋(shi)液(ye)將標(biao)本(ben)進(jin)行適當稀釋(shi)后再進(jin)行實驗。

檢測前準備工作：

1.大鼠CREB結合蛋白(CREBBP)試劑盒請(qing)提前20分鐘從冰(bing)箱中取出試劑盒(he)，平衡至室溫。

2.從冰(bing)箱中取(qu)出(chu)的(de)濃(nong)縮(suo)洗滌(di)(di)液可(ke)能有結晶(jing)，屬于正(zheng)常(chang)現象；放(fang)置室(shi)溫，輕搖均勻，待(dai)結晶(jing)溶解后(hou)再配(pei)置洗滌(di)(di)液。可(ke)將20ml濃(nong)縮(suo)洗滌(di)(di)液用(yong)蒸(zheng)餾水或去離子水稀釋配(pei)置成400ml工作(zuo)濃(nong)度的(de)洗滌(di)(di)液，未用(yong)完的(de)放(fang)回4℃

3.20×洗滌緩沖(chong)液(ye)(ye)的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾水按1：20稀(xi)釋，即1份(fen)20×洗滌緩沖(chong)液(ye)(ye)加19份(fen)蒸(zheng)餾水。

實驗原理：

試(shi)劑盒采(cai)用(yong)雙抗體(ti)(ti)一步(bu)夾心(xin)法酶聯(lian)免(mian)疫吸附試(shi)驗（ELISA）。往(wang)預先包被大鼠CREB結合蛋(dan)白(CREBBP)捕獲抗體(ti)(ti)的(de)(de)(de)包被微(wei)孔(kong)中，依次加入標本、標準(zhun)品、HRP標記的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)抗體(ti)(ti)，經過(guo)(guo)溫(wen)育并洗滌。用(yong)底(di)物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過(guo)(guo)氧化(hua)(hua)物酶的(de)(de)(de)催化(hua)(hua)下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)藍色(se)，并在(zai)酸的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)的(de)(de)(de)黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)(de)大鼠CREB結合蛋(dan)白(CREBBP)呈正(zheng)相關(guan)。用(yong)酶標儀在(zai)450nm 波(bo)長下(xia)(xia)測(ce)定吸光(guang)度(du)（OD 值），計算(suan)樣品濃度(du)。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水或去離(li)子水

樣本處理及要求：

1.血(xue)清：將收集于(yu)血(xue)清分(fen)離(li)(li)管的(de)全(quan)血(xue)標本(ben)在(zai)室溫(wen)放置2小時或4℃過(guo)夜，然(ran)后1000×g離(li)(li)心20 分(fen)鐘，取上清即(ji)可，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗凝劑采集標本，并將(jiang)標本在采集后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心(xin)15分鐘，取上清(qing)即(ji)可檢測(ce)，或(huo)將(jiang)上清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免(mian)反(fan)復凍融。

3.組織(zhi)勻(yun)(yun)漿(jiang)：用(yong)預冷(leng)的(de)(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織(zhi)，去除(chu)殘留血液(ye)（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂(lie)解(jie)的(de)(de)(de)(de)紅細胞(bao)(bao)會影響測(ce)量結果），稱(cheng)重(zhong)后將(jiang)組織(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的(de)(de)(de)(de)組織(zhi)與對應體(ti)積(ji)的(de)(de)(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)(de)(de)重(zhong)量體(ti)積(ji)比，比如(ru)1g的(de)(de)(de)(de)組織(zhi)樣品對應9mL的(de)(de)(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據實(shi)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋(dan)白酶抑制劑）加(jia)入(ru)玻璃(li)勻(yun)(yun)漿(jiang)器中，于冰上(shang)充分(fen)(fen)研磨。為(wei)了(le)進一(yi)步裂(lie)解(jie)組織(zhi)細胞(bao)(bao)，可以(yi)對勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)進行超聲破碎，或(huo)反(fan)復凍融(rong)。將(jiang)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分(fen)(fen)鐘，取上(shang)清(qing)檢測(ce)。

4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上清即可(ke)檢測，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢(jian)測。

6.樣品外觀(guan)：樣品應清澈透明，懸(xuan)浮物(wu)應離心(xin)去除。

7.樣品(pin)保存：樣品(pin)收集后若在1周內進行檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)可保存于4℃，若不能(neng)及時檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，請按一次使用量(liang)分(fen)裝，凍存于-20℃（1個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)(ce)），或-80℃（6個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)(ce)），避免反(fan)復凍融，標(biao)本溶血(xue)會影響檢(jian)(jian)測(ce)(ce)結(jie)果，因此溶血(xue)標(biao)本不宜(yi)進行此項檢(jian)(jian)測(ce)(ce)。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和溫(wen)度進行溫(wen)育(yu)以保(bao)證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫(wen)20-25℃。使用后(hou)立即冷藏保(bao)存試劑。

2.洗(xi)板不(bu)正確可以導(dao)致不(bu)準(zhun)確的(de)結果(guo)。在加(jia)入(ru)底(di)物前確保盡量吸干(gan)孔內液體。溫育過程中不(bu)要讓微(wei)孔干(gan)燥掉。

3.消除(chu)板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.底物顯(xian)色液應呈無(wu)色或很淺(qian)的顏色，已經變藍的底物液不能使用(yong)。

5.避(bi)免試劑和標本的交叉污(wu)染以免造成(cheng)錯誤(wu)結果。

6.在(zai)儲存和溫育(yu)時避免(mian)強光直接(jie)照射。

7.平(ping)衡(heng)至室(shi)溫后再(zai)打開(kai)密封袋以防水滴凝聚在冷板條(tiao)上。

8.任何反應試劑不(bu)能接(jie)觸漂(piao)白(bai)(bai)溶(rong)劑或漂(piao)白(bai)(bai)溶(rong)劑所散發的強(qiang)烈(lie)氣體。任何漂(piao)白(bai)(bai)成分(fen)都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活(huo)性(xing)。

9.不(bu)能使(shi)用過期(qi)產(chan)品。

10.如果可(ke)能傳播疾病，所有的樣(yang)品(pin)都(dou)應管理(li)好，按照規定的程(cheng)序處理(li)樣(yang)品(pin)和(he)檢測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡60min后(hou)的(de)鋁箔袋中取出(chu)所需板條，剩余(yu)板條用自封(feng)袋密封(feng)放(fang)回4℃。

2．設置標(biao)準品孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)，標(biao)準品孔(kong)(kong)各加不同濃度的標(biao)準品50μL。

3．樣本孔(kong)中a加入待測樣本50μL；空白孔(kong)不加。

4．除空白孔(kong)(kong)(kong)外(wai)，標準品孔(kong)(kong)(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)(kong)(kong)中每(mei)孔(kong)(kong)(kong)加入辣(la)根過氧化物酶(mei)（HRP）標記的檢測抗體(ti)100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔(kong)(kong)(kong)，37℃水(shui)浴鍋(guo)或恒(heng)溫箱溫育(yu)60min。

5．棄去(qu)液(ye)體，吸水紙上(shang)拍干，每(mei)孔(kong)加滿洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗滌液(ye)，吸水紙上(shang)拍干，如此(ci)重復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6．每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測(ce)定各孔的OD值(zhi)。

實驗結果計算：

繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)(qu)線：在Excel工作表(biao)中，以標準(zhun)品(pin)濃(nong)(nong)度作橫坐標，對應OD值作縱(zong)坐標，繪(hui)制出標準(zhun)品(pin)線性回歸曲(qu)(qu)線，按(an)曲(qu)(qu)線方程計(ji)算各樣(yang)本濃(nong)(nong)度值。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢測范(fan)圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度(du)：檢測濃度(du)小于1.0 pg/mL。

3.特(te)異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應(ying)。

4.重復性：板(ban)內變(bian)異系數小于10% ，板(ban)間變(bian)異系數小于15% 。

技術小提示：

1.當混合或重(zhong)溶(rong)蛋白溶(rong)液時，盡量(liang)避免起沫。

2.為了大鼠CREB結合蛋白(CREBBP)試劑盒避免交叉感染，配置不(bu)同(tong)(tong)濃度(du)標準品、上樣(yang)、加不(bu)同(tong)(tong)試(shi)(shi)劑(ji)都需要(yao)更(geng)換槍頭。另外(wai)不(bu)同(tong)(tong)試(shi)(shi)劑(ji)請分(fen)別使用不(bu)同(tong)(tong)的移液槽。

3.每次孵育時，請(qing)正確使用封(feng)板膠可保證結果的準確性(xing)。

4.混合后的(de)顯色底物(wu)在上板前應為無(wu)色，請避(bi)光保存；假如微孔板后，將由物(wu)色變(bian)成不同(tong)深度(du)的(de)藍(lan)色。

5.終止液(ye)(ye)上(shang)板(ban)順序應同顯色底物(wu)上(shang)板(ban)順序一(yi)致(zhi)；加入終止液(ye)(ye)后，孔內顏色由藍變黃；若孔內有綠色，則表明孔內液(ye)(ye)體未混勻；請充分混合(he)。

說明：

1.由于現(xian)有條件及科(ke)學技術水平尚不能對所有供(gong)貨商(shang)提供(gong)的所有原料(liao)進行全面的鑒定與分析，本(ben)產品可能存在一定的質量(liang)技術風險。

2.實(shi)驗結果與(yu)試劑(ji)的有效性、實(shi)驗者的相關操作以及當時的實(shi)驗環(huan)境密切相關，請務必準備(bei)充足的標本備(bei)份。

3.不同批次的同一(yi)產品(pin)可能會有少許(xu)差別，如(ru)：檢測限、靈敏度以(yi)及顯色時間(jian)等，請依據試劑盒內(nei)說明書(shu)進行實(shi)驗操作，網(wang)站(zhan)電子版說明書(shu)僅作參考(kao)。

4.只(zhi)有(you)全部使用本試(shi)(shi)劑盒配套試(shi)(shi)劑才能(neng)保證檢測(ce)效果(guo)，不能(neng)混用其他制造(zao)商(shang)的(de)產品。只(zhi)有(you)嚴(yan)格遵守本試(shi)(shi)劑盒的(de)實驗說明才會得到(dao)檢測(ce)結果(guo)。