人Runt相關轉錄因子2(RUNX2)試劑盒

本試劑盒僅供體外(wai)研究使用，不用于(yu)臨(lin)床(chuang)診(zhen)斷

本(ben)(ben)試劑盒用于體(ti)外定量(liang)檢測血(xue)清、血(xue)漿(jiang)、組(zu)織勻漿(jiang)及相關液(ye)體(ti)樣本(ben)(ben)中人Runt相關轉錄(lu)因子(zi)2(RUNX2)的含量(liang)。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查(cha)所有物(wu)品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正(zheng)常標本(ben)檢驗，標本(ben)的正(zheng)常濃(nong)度值(zhi)均在試(shi)劑盒(he)提供的檢測范圍內，實(shi)驗過程中直接取(qu)50μL樣本(ben)上樣即(ji)可。當有部分樣本(ben)值(zhi)超過大標準品濃(nong)度時(shi)，可用樣本(ben)稀(xi)釋液(ye)將標本(ben)進(jin)行適當稀(xi)釋后再進(jin)行實(shi)驗。

檢測前準備工作：

1.請提前20分鐘從冰箱(xiang)中(zhong)取(qu)出試劑盒，平衡至(zhi)室(shi)溫。

2.從冰(bing)箱中取出(chu)的(de)濃(nong)縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)可能有(you)結晶，屬于正常(chang)現(xian)象；放(fang)置(zhi)室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置(zhi)洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)。可將20ml濃(nong)縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)用蒸餾水或(huo)去離子(zi)水稀釋配置(zhi)成400ml工(gong)作濃(nong)度的(de)洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)，未用完的(de)放(fang)回4℃

3.20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖(chong)液的稀釋：蒸餾水按(an)1：20稀釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖(chong)液加19份(fen)蒸餾水。

實驗原理：

人Runt相關轉錄因子2(RUNX2)試劑盒采(cai)用(yong)雙抗體(ti)一步夾(jia)心(xin)法(fa)酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先(xian)包(bao)被人Runt相關轉(zhuan)錄因子(zi)(zi)2(RUNX2)捕獲抗體(ti)的(de)(de)包(bao)被微孔中(zhong)，依次加入(ru)標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)(de)檢測抗體(ti)，經過溫育(yu)并(bing)洗滌。用(yong)底物TMB顯色，TMB在過氧化(hua)物酶的(de)(de)催化(hua)下轉(zhuan)化(hua)成藍色，并(bing)在酸的(de)(de)作用(yong)下轉(zhuan)化(hua)成終(zhong)的(de)(de)黃色。顏色的(de)(de)深淺和(he)樣品(pin)中(zhong)的(de)(de)人Runt相關轉(zhuan)錄因子(zi)(zi)2(RUNX2)呈正相關。用(yong)酶標(biao)儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度（OD 值(zhi)），計算樣品(pin)濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾水(shui)或去離(li)子(zi)水(shui)

樣本處理及要求：

1.血(xue)(xue)清(qing)：將收集于血(xue)(xue)清(qing)分離管(guan)的(de)全血(xue)(xue)標本(ben)在室溫放置2小時或4℃過夜，然后(hou)1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即可(ke)，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.血(xue)漿：用EDTA或(huo)(huo)肝(gan)素作為抗凝劑采集標本(ben)，并將(jiang)標本(ben)在采集后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢(jian)測(ce)，或(huo)(huo)將(jiang)上清置于(yu)-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.組(zu)織(zhi)勻漿：用預(yu)冷(leng)的(de)(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去除殘留血(xue)液(ye)（勻漿中(zhong)裂解(jie)的(de)(de)(de)(de)紅細(xi)胞會影響(xiang)測量(liang)結果(guo)），稱重后將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎。將(jiang)剪(jian)碎的(de)(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)與對應體積(ji)的(de)(de)(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)(de)(de)重量(liang)體積(ji)比，比如1g的(de)(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)品(pin)對應9mL的(de)(de)(de)(de)PBS，具體體積(ji)可根據實驗需(xu)要適當調整，并(bing)做好記(ji)錄。推(tui)薦(jian)在PBS中(zhong)加入蛋白酶(mei)抑制劑）加入玻(bo)璃勻漿器中(zhong)，于(yu)冰上(shang)充分研(yan)磨。為了進(jin)一(yi)步裂解(jie)組(zu)織(zhi)細(xi)胞，可以對勻漿液(ye)進(jin)行超(chao)聲破碎，或反復凍(dong)融。后將(jiang)勻漿液(ye)于(yu)5000×g離心(xin)5~10分鐘，取上(shang)清檢測。

4.細胞培養物上(shang)清(qing)(qing)：請1000×g離心20分鐘，取上(shang)清(qing)(qing)即可檢測，或(huo)將上(shang)清(qing)(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品(pin)外觀：樣品(pin)應(ying)清澈透明，懸浮物應(ying)離心去除。

7.樣(yang)品保存(cun)：樣(yang)品收集后(hou)若(ruo)在1周內進行檢(jian)(jian)測的(de)可(ke)保存(cun)于(yu)4℃，若(ruo)不能及時檢(jian)(jian)測，請按一次使用(yong)量分(fen)裝，凍存(cun)于(yu)-20℃（1個月(yue)內檢(jian)(jian)測），或-80℃（6個月(yue)內檢(jian)(jian)測），避(bi)免反復凍融，標本溶血會影響后(hou)檢(jian)(jian)測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢(jian)(jian)測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育(yu)以(yi)保(bao)證準確(que)結果(guo)。所有試(shi)劑都必須在使用(yong)前達到室溫20-25℃。使用(yong)后立即(ji)冷藏保(bao)存試(shi)劑。

2.洗(xi)板不(bu)正確可以導致(zhi)不(bu)準確的結(jie)果。在加入底物前確保盡量(liang)吸干孔內液(ye)體。溫育過程中(zhong)不(bu)要讓微孔干燥掉。

3.消除板底殘留的液體(ti)和(he)手指印，否則(ze)影響OD值。

4.底物(wu)顯色(se)液應呈無色(se)或很淺的顏色(se)，已經(jing)變藍(lan)的底物(wu)液不能(neng)使用。

5.避(bi)免試劑和(he)標本的交叉污(wu)染以免造(zao)成錯誤結果。

6.在儲(chu)存和溫育時避免強光直接照射。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在(zai)冷板條上。

8.任(ren)何(he)反應試劑(ji)不能(neng)接觸漂白溶劑(ji)或漂白溶劑(ji)所散發(fa)的強烈(lie)氣體。任(ren)何(he)漂白成分都(dou)會破壞試劑(ji)盒中反應試劑(ji)的生物活性。

9.不能使用(yong)過期產品(pin)。

10.如果(guo)可能傳播疾病(bing)，所(suo)有的樣品都應管理好，按照規(gui)定的程序處(chu)理樣品和檢測裝置。

操作步驟：

1．從室溫(wen)平衡60min后的(de)鋁箔袋中(zhong)取出所需板條(tiao)(tiao)，剩余板條(tiao)(tiao)用(yong)自封(feng)袋密封(feng)放回(hui)4℃。

2．設(she)置標準(zhun)品孔和(he)樣本孔，標準(zhun)品孔各(ge)加不同(tong)濃度的標準(zhun)品50μL。

3．樣本孔中a加入待測(ce)樣本50μL；空白孔不加。

4．除空(kong)白孔(kong)(kong)外，標準品孔(kong)(kong)和(he)樣本孔(kong)(kong)中每(mei)孔(kong)(kong)加入辣根過氧化物酶(mei)（HRP）標記的檢(jian)測抗體100μL，用封板膜封住(zhu)反應孔(kong)(kong)，37℃水(shui)浴鍋或(huo)恒溫箱溫育60min。

5．棄(qi)去(qu)(qu)液體，吸水紙上拍(pai)干(gan)，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去(qu)(qu)洗滌液，吸水紙上拍(pai)干(gan)，如(ru)此重(zhong)復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6．每孔加入底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的(de)OD值。

實驗結果計算：

繪制(zhi)標準(zhun)曲(qu)線：在Excel工作表中(zhong)，以標準(zhun)品(pin)濃度作橫(heng)坐標，對應OD值(zhi)作縱(zong)坐標，繪制(zhi)出標準(zhun)品(pin)線性回歸曲(qu)線，按曲(qu)線方程(cheng)計算各樣(yang)本濃度值(zhi)。

（此圖僅供參考）

性能：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度(du)：低檢測濃度(du)小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與(yu)其它可溶(rong)性結構類似物(wu)交叉反應。

4.重復性：板內變(bian)異系(xi)數小于10% ，板間變(bian)異系(xi)數小于15% 。

人Runt相關轉錄因子2(RUNX2)試劑盒技術小提示：

1.當(dang)混合或重溶蛋白溶液時(shi)，盡量避免起沫(mo)。

2.為了避(bi)免交叉感染，配置(zhi)不(bu)同濃度標準品、上(shang)樣、加不(bu)同試劑都需要更換槍(qiang)頭。另(ling)外不(bu)同試劑請分別使用不(bu)同的移液槽。

3.每次孵育(yu)時(shi)，請(qing)正確(que)使用封板膠可保證結(jie)果的準確(que)性。

4.混合后的(de)顯色(se)(se)底物在上板前(qian)應為(wei)無色(se)(se)，請(qing)避光保存；假如(ru)微孔板后，將(jiang)由(you)物色(se)(se)變成不同深度的(de)藍(lan)色(se)(se)。

5.終止液上(shang)板順序應同顯色底物上(shang)板順序一致；加入終止液后，孔(kong)(kong)內(nei)顏(yan)色由(you)藍變黃；若孔(kong)(kong)內(nei)有(you)綠色，則表明孔(kong)(kong)內(nei)液體未混(hun)勻；請(qing)充分(fen)混(hun)合。

說明：

1.由于現有條件及科學技(ji)術水平尚不能對(dui)所有供(gong)貨商提供(gong)的(de)所有原料進行全(quan)面的(de)鑒定與(yu)分(fen)析(xi)，本產品(pin)可能存在(zai)一定的(de)質量技(ji)術風險。

2.終的實(shi)(shi)驗結果與試劑的有(you)效性、實(shi)(shi)驗者的相關(guan)操作以(yi)及當(dang)時的實(shi)(shi)驗環(huan)境密切(qie)相關(guan)，請務(wu)必準備(bei)充(chong)足(zu)的標本(ben)備(bei)份。

3.不同批次的(de)同一產品可能(neng)會有少許差(cha)別，如(ru)：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請(qing)依據試(shi)劑(ji)盒內說明書進行實驗操(cao)作，網站電(dian)子版說明書僅作參考。

4.只(zhi)有全部使(shi)用本(ben)試(shi)劑盒配套(tao)試(shi)劑才能保證檢(jian)測(ce)效果(guo)，不能混用其他制造(zao)商(shang)的產(chan)品。只(zhi)有嚴(yan)格遵(zun)守本(ben)試(shi)劑盒的實驗說明才會得到佳的檢(jian)測(ce)結果(guo)。