本試劑盒(he)僅供體(ti)外(wai)研究使用，不用于臨床診斷(duan)

本試劑盒用于體外定量(liang)檢測血清(qing)、血漿、組織勻漿及相關(guan)液體樣本中雞(ji)表皮生長因子(EGF)的含量(liang)。

有效期：6個月

保存條(tiao)件：2-8℃

雞表(biao)皮生(sheng)長因子(zi)(EGF)ELISA試劑盒組成：

備注(zhu)：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全(quan)。

2. 標準品(pin)濃度依次(ci)為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正常標本(ben)(ben)檢驗，標本(ben)(ben)的(de)正常濃度(du)值均在試劑盒(he)提(ti)供(gong)的(de)檢測(ce)范圍(wei)內，實驗過程中直(zhi)接取50μL樣本(ben)(ben)上樣即可(ke)。當有部分樣本(ben)(ben)值超過標準(zhun)品(pin)濃度(du)時，可(ke)用(yong)樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)液將標本(ben)(ben)進(jin)行適當稀(xi)釋(shi)后再進(jin)行實驗。

檢測前準備工作(zuo)：

1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中(zhong)取出(chu)的(de)濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)可(ke)能有(you)結(jie)晶，屬(shu)于正(zheng)常現象；放置(zhi)室溫(wen)，輕搖均(jun)勻，待(dai)結(jie)晶溶解后再配置(zhi)洗滌液(ye)。可(ke)將(jiang)20ml濃(nong)縮(suo)洗滌液(ye)用蒸餾水或去離子水稀釋配置(zhi)成(cheng)400ml工作(zuo)濃(nong)度的(de)洗滌液(ye)，未用完的(de)放回4℃

3.20×洗滌(di)緩沖液(ye)的(de)稀釋：蒸(zheng)(zheng)餾水(shui)按(an)1：20稀釋，即(ji)1份20×洗滌(di)緩沖液(ye)加19份蒸(zheng)(zheng)餾水(shui)。

實驗原(yuan)理(li)：

試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗體(ti)一步夾(jia)心法酶聯免疫(yi)吸附試驗（ELISA）。往(wang)預先包(bao)被(bei)雞表(biao)皮生(sheng)長因子(zi)(EGF)捕獲(huo)抗體(ti)的包(bao)被(bei)微孔(kong)中(zhong)，依次(ci)加入標本、標準(zhun)品、HRP標記的檢測抗體(ti)，經過溫(wen)育并洗滌。用(yong)底(di)物TMB顯色(se)(se)(se)(se)，TMB在過氧(yang)化(hua)(hua)物酶的催化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)藍(lan)色(se)(se)(se)(se)，并在酸的作用(yong)下轉化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)最(zui)終的黃色(se)(se)(se)(se)。顏色(se)(se)(se)(se)的深淺和樣品中(zhong)的雞表(biao)皮生(sheng)長因子(zi)(EGF)呈正相關。用(yong)酶標儀(yi)在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

實驗所需自備試(shi)驗器(qi)材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫(wen)箱

4.蒸餾(liu)水(shui)或去(qu)離子水(shui)

樣本處理及要(yao)求：

1.血(xue)(xue)清(qing)：將收集于血(xue)(xue)清(qing)分離管的全血(xue)(xue)標(biao)本在室溫放置(zhi)2小(xiao)時或4℃過夜(ye)，然后1000×g離心20 分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)即可，或將上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。

2.血漿：用(yong)EDTA或(huo)肝(gan)素作為抗(kang)凝劑采集標本(ben)(ben)，并將標本(ben)(ben)在(zai)采集后的30分(fen)鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上清(qing)即可(ke)檢測(ce)，或(huo)將上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免反(fan)復凍融。

3.組(zu)(zu)織勻(yun)漿(jiang)(jiang)：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)(zu)織，去除殘(can)留(liu)血液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)中裂解的(de)紅細胞(bao)會影響測量結果），稱重后將(jiang)(jiang)組(zu)(zu)織剪(jian)(jian)碎(sui)。將(jiang)(jiang)剪(jian)(jian)碎(sui)的(de)組(zu)(zu)織與對應(ying)體(ti)積的(de)PBS（一(yi)般(ban)按1:9的(de)重量體(ti)積比(bi)，比(bi)如(ru)1g的(de)組(zu)(zu)織樣(yang)品對應(ying)9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實(shi)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦(jian)在PBS中加入蛋白(bai)酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)器中，于冰上充(chong)分研磨。為了進一(yi)步(bu)裂解組(zu)(zu)織細胞(bao)，可以對勻(yun)漿(jiang)(jiang)液進行超聲破碎(sui)，或反(fan)復(fu)凍(dong)融。最后將(jiang)(jiang)勻(yun)漿(jiang)(jiang)液于5000×g離心(xin)5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養物(wu)上(shang)(shang)清(qing)：請1000×g離(li)心20分鐘，取上(shang)(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將上(shang)(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它(ta)生物標本：1000×g離心20分鐘，取上(shang)清即可檢測(ce)。

6.樣品外觀：樣品應清澈(che)透(tou)明，懸浮物應離心去除。

7.樣品保存(cun)：樣品收集后若在1周(zhou)內(nei)進行(xing)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的可保存(cun)于(yu)4℃，若不能及(ji)時檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，請按一次(ci)使(shi)用量分(fen)裝，凍(dong)存(cun)于(yu)-20℃（1個月內(nei)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)），或-80℃（6個月內(nei)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)），避免反(fan)復凍(dong)融，標本溶血會影響檢(jian)(jian)測(ce)(ce)結果，因此溶血標本不宜進行(xing)此項檢(jian)(jian)測(ce)(ce)。

注意(yi)事項：

1.嚴格按(an)照(zhao)規定的(de)時間和溫度(du)進行溫育以保證準確(que)結(jie)果。所(suo)有試劑都必須在(zai)使用(yong)前達到室溫20-25℃。使用(yong)后立即冷藏保存試劑。

2.洗板不正確(que)可以導致不準確(que)的(de)結果。在加(jia)入底物前確(que)保(bao)盡量吸干孔(kong)內液體。溫育過程中不要(yao)讓微孔(kong)干燥(zao)掉。

3.消(xiao)除板底殘留(liu)的液體和手指(zhi)印，否則影響OD值。

4.底(di)物顯色(se)液(ye)(ye)應呈無(wu)色(se)或很(hen)淺的顏色(se)，已(yi)經變(bian)藍(lan)的底(di)物液(ye)(ye)不能使用。

5.避免試劑(ji)和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6.在(zai)儲存和(he)溫育時避免強光直接照射。

7.平衡至室(shi)溫后再打開密封袋(dai)以防(fang)水滴凝(ning)聚在(zai)冷板條上。

8.任何反(fan)應試(shi)劑(ji)(ji)不能(neng)接(jie)觸(chu)漂白(bai)溶劑(ji)(ji)或漂白(bai)溶劑(ji)(ji)所散發的強烈氣體。任何漂白(bai)成分都會破壞試(shi)劑(ji)(ji)盒中反(fan)應試(shi)劑(ji)(ji)的生物(wu)活性。

9.不能(neng)使用過(guo)期產品。

10.如果(guo)可能傳播疾病，所(suo)有的(de)樣(yang)品都(dou)應(ying)管理好，按照規定的(de)程序處理樣(yang)品和(he)檢(jian)測(ce)裝置。

雞表皮生長因子(EGF)ELISA試劑盒操作步(bu)驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中(zhong)取出所(suo)需板條，剩(sheng)余板條用(yong)自封(feng)袋密封(feng)放回(hui)4℃。

2．設(she)置(zhi)標(biao)準(zhun)品孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)，標(biao)準(zhun)品孔(kong)各加不同濃度的標(biao)準(zhun)品50μL。

3．樣本孔(kong)中a加入(ru)待(dai)測樣本50μL；空白(bai)孔(kong)不(bu)加。

4．除(chu)空白孔(kong)外(wai)，標準(zhun)品孔(kong)和(he)樣(yang)本孔(kong)中每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)辣根(gen)過氧化物酶(mei)（HRP）標記的(de)檢測抗體100μL，用封(feng)板(ban)膜封(feng)住反(fan)應孔(kong)，37℃水浴(yu)鍋或(huo)恒溫(wen)(wen)箱溫(wen)(wen)育(yu)60min。

5．棄去(qu)液體，吸水(shui)(shui)紙上(shang)拍干，每孔加滿洗(xi)滌液（350μL），靜置(zhi)1min，甩去(qu)洗(xi)滌液，吸水(shui)(shui)紙上(shang)拍干，如此(ci)重復洗(xi)板5次(ci)（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6．每孔加(jia)入底物(wu)A、B各50μL，37℃避(bi)光孵育(yu)15min。

7．每孔(kong)加(jia)入終(zhong)止液50μL，15min內(nei)，在(zai)450nm波長處(chu)測定(ding)各(ge)孔(kong)的(de)OD值。

實驗結果計算：

繪制標(biao)準(zhun)(zhun)曲線(xian)：在Excel工作表中，以(yi)標(biao)準(zhun)(zhun)品濃度(du)(du)作橫(heng)坐(zuo)標(biao)，對應OD值作縱坐(zuo)標(biao)，繪制出標(biao)準(zhun)(zhun)品線(xian)性回歸曲線(xian)，按曲線(xian)方程計算各樣本濃度(du)(du)值。

（此圖僅(jin)供參考(kao)）

性能：

1. 檢(jian)測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏(min)度：檢(jian)測濃(nong)度小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結(jie)構類似物交叉反應。

4.重復性(xing)：板內(nei)變異(yi)系數(shu)小(xiao)于10% ，板間變異(yi)系數(shu)小(xiao)于15% 。

技術(shu)小提示(shi)：

1.當(dang)混合或重溶(rong)蛋白溶(rong)液時，盡(jin)量避(bi)免(mian)起沫。

2.為了(le)避(bi)免交叉感染，配置不同(tong)濃度標準(zhun)品、上樣、加不同(tong)試劑都需要更(geng)換槍頭。另外不同(tong)試劑請分(fen)別(bie)使(shi)用不同(tong)的移(yi)液(ye)槽。

3.每次孵育時，請正確(que)使用封板膠可保證結果的準確(que)性(xing)。

4.混合后的顯(xian)色(se)底(di)物在上(shang)板前應(ying)為無色(se)，請避光保存；假(jia)如(ru)微孔板后，將由物色(se)變成不同深度的藍(lan)色(se)。

5.終止液(ye)上(shang)板(ban)順(shun)序應同顯色底(di)物(wu)上(shang)板(ban)順(shun)序一致；加(jia)入(ru)終止液(ye)后，孔(kong)內顏(yan)色由藍(lan)變黃；若(ruo)孔(kong)內有綠色，則表明孔(kong)內液(ye)體未(wei)混勻；請充分混合。

說明：

1.由于現有條件及科學技(ji)術水平尚(shang)不能對所(suo)有供貨商提供的(de)(de)所(suo)有原料進行全面(mian)的(de)(de)鑒(jian)定(ding)與分析(xi)，本產品可能存在(zai)一定(ding)的(de)(de)質量(liang)技(ji)術風險(xian)。

2.實(shi)驗(yan)結果與試劑的有效(xiao)性、實(shi)驗(yan)者的相關操作以(yi)及當時(shi)的實(shi)驗(yan)環境(jing)密切相關，請務必準備(bei)充(chong)足的標本備(bei)份。

3.不同(tong)批次的同(tong)一(yi)產品可能會有(you)少許差別，如(ru)：檢測限、靈敏(min)度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)進(jin)行實驗操作(zuo)，網站電子版(ban)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)僅作(zuo)參考。

4.只(zhi)有(you)全部使用本(ben)試(shi)劑盒(he)配套(tao)試(shi)劑才能(neng)保證檢測效果，不能(neng)混用其(qi)他(ta)制造商(shang)的產品。只(zhi)有(you)嚴格遵守本(ben)試(shi)劑盒(he)的實驗說明才會得到檢測結(jie)果。