本試劑盒(he)僅供體外研究使用，不(bu)用于臨床診斷

本試劑盒用于體外定量(liang)檢測(ce)血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中(zhong)大(da)鼠(shu)Bcl-2相關X蛋白(Bax)的含量(liang)。

有效(xiao)期：6個月

保(bao)存(cun)條件：2-8℃

大鼠(shu)Bcl-2相(xiang)關X蛋白(bai)(Bax)ELISA試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大(da)量正常標(biao)(biao)本(ben)(ben)檢驗，標(biao)(biao)本(ben)(ben)的正常濃(nong)度(du)值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實(shi)(shi)驗過程中直(zhi)接取50μL樣本(ben)(ben)上樣即可(ke)。當(dang)有部分樣本(ben)(ben)值超(chao)過標(biao)(biao)準品濃(nong)度(du)時，可(ke)用樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)液將標(biao)(biao)本(ben)(ben)進行(xing)適當(dang)稀(xi)釋(shi)后再進行(xing)實(shi)(shi)驗。

檢測前(qian)準備工作：

1.請提前20分鐘從冰箱(xiang)中取出試劑(ji)盒，平衡至(zhi)室溫。

2.從冰箱中(zhong)取出(chu)的(de)(de)濃(nong)(nong)縮洗滌液可(ke)能有結(jie)晶(jing)，屬于正常現(xian)象；放(fang)(fang)置(zhi)室溫，輕搖均勻(yun)，待結(jie)晶(jing)溶解后再(zai)配置(zhi)洗滌液。可(ke)將20ml濃(nong)(nong)縮洗滌液用蒸餾(liu)水(shui)(shui)或去離子水(shui)(shui)稀釋配置(zhi)成400ml工作濃(nong)(nong)度的(de)(de)洗滌液，未用完的(de)(de)放(fang)(fang)回4℃

3.20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液的稀釋：蒸(zheng)餾(liu)水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液加19份蒸(zheng)餾(liu)水。

實驗原理：

試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗體一步夾心法酶聯免疫(yi)吸(xi)附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠Bcl-2相(xiang)關(guan)X蛋白(Bax)捕獲抗體的(de)(de)包被微孔中(zhong)，依次加入標本、標準(zhun)品、HRP標記的(de)(de)檢(jian)測抗體，經(jing)過溫育(yu)并洗滌。用(yong)底(di)物TMB顯色(se)，TMB在過氧化(hua)(hua)物酶的(de)(de)催化(hua)(hua)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)藍(lan)色(se)，并在酸的(de)(de)作用(yong)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)黃色(se)。顏色(se)的(de)(de)深淺和樣品中(zhong)的(de)(de)大鼠Bcl-2相(xiang)關(guan)X蛋白(Bax)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關(guan)。用(yong)酶標儀(yi)在450nm 波(bo)長(chang)下測定吸(xi)光度（OD 值），計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器(qi)材(cai)：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加(jia)樣器(qi)及槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫箱

4.蒸餾水或去離子水

樣(yang)本處理及要求：

1.血清(qing)：將收(shou)集于血清(qing)分離管的全血標本在室溫放置2小時或(huo)4℃過夜(ye)，然后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即可，或(huo)將上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.血漿：用(yong)EDTA或肝素作為抗凝劑采(cai)集標本(ben)，并將(jiang)標本(ben)在采(cai)集后的(de)30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取(qu)上(shang)清(qing)即可檢(jian)測，或將(jiang)上(shang)清(qing)置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避(bi)免反復凍融(rong)。

3.組(zu)織(zhi)勻漿(jiang)：用(yong)預冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去除殘(can)留血液(ye)（勻漿(jiang)中裂(lie)解的(de)(de)紅細(xi)(xi)胞會(hui)影響測量結果），稱重(zhong)后將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎。將(jiang)剪(jian)碎的(de)(de)組(zu)織(zhi)與對應體積的(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)重(zhong)量體積比，比如(ru)1g的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣品(pin)對應9mL的(de)(de)PBS，具體體積可(ke)(ke)根據(ju)實驗需要適(shi)當調整，并做好記錄。推薦(jian)在PBS中加入(ru)蛋白(bai)酶抑制劑）加入(ru)玻璃勻漿(jiang)器中，于(yu)冰上充分(fen)研磨。為了進(jin)一步裂(lie)解組(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞，可(ke)(ke)以(yi)對勻漿(jiang)液(ye)進(jin)行(xing)超聲破碎，或反復凍(dong)融。將(jiang)勻漿(jiang)液(ye)于(yu)5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4.細(xi)胞(bao)培養物上清：請1000×g離心(xin)20分鐘，取上清即可檢(jian)測，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應避免(mian)反復凍融。

5.其它(ta)生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢(jian)測。

6.樣(yang)品外觀(guan)：樣(yang)品應清澈透明(ming)，懸浮(fu)物應離心(xin)去除。

7.樣品保存(cun)(cun)：樣品收集后若(ruo)在1周內(nei)(nei)進行檢(jian)(jian)測的(de)可保存(cun)(cun)于4℃，若(ruo)不能及(ji)時(shi)檢(jian)(jian)測，請(qing)按一次使用(yong)量分裝，凍存(cun)(cun)于-20℃（1個月內(nei)(nei)檢(jian)(jian)測），或-80℃（6個月內(nei)(nei)檢(jian)(jian)測），避免(mian)反復凍融，標(biao)本(ben)溶血會影響最(zui)后檢(jian)(jian)測結(jie)果(guo)，因此溶血標(biao)本(ben)不宜(yi)進行此項檢(jian)(jian)測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和(he)溫度進行溫育以保(bao)證準(zhun)確結果。所(suo)有試劑(ji)都必須在使用前(qian)達(da)到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷藏保(bao)存試劑(ji)。

2.洗板不(bu)正確可(ke)以導致不(bu)準確的結果。在加入底物前確保盡量(liang)吸干(gan)孔內液體。溫育過程中不(bu)要讓(rang)微孔干(gan)燥掉。

3.消除(chu)板(ban)底殘留的(de)液體和手指印，否則影(ying)響(xiang)OD值。

4.底物顯色液(ye)應呈無(wu)色或(huo)很淺(qian)的(de)顏色，已經變(bian)藍的(de)底物液(ye)不能使用。

5.避免試(shi)劑和標本的交叉污(wu)染(ran)以免造成錯誤結果。

6.在儲存和溫育時避(bi)免強光直接照射。

7.平衡至(zhi)室(shi)溫后再(zai)打開密(mi)封袋以防水滴凝聚(ju)在冷板條上。

8.任(ren)(ren)何反應試劑(ji)不能接觸(chu)漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)或漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)所散發的(de)強(qiang)烈氣體。任(ren)(ren)何漂(piao)白成分都(dou)會破壞(huai)試劑(ji)盒(he)中反應試劑(ji)的(de)生(sheng)物(wu)活性。

9.不能使用過期(qi)產品。

10.如(ru)果可能傳播(bo)疾病，所有的樣品(pin)都(dou)應管理(li)好，按照(zhao)規定(ding)的程序(xu)處(chu)理(li)樣品(pin)和檢(jian)測裝(zhuang)置。

操作步驟：

1．從室(shi)溫平衡60min后(hou)的(de)鋁箔袋中取出(chu)所需板條，剩余板條用自(zi)封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2．設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各(ge)加不(bu)同濃度的標準品50μL。

3．樣本孔(kong)中a加(jia)入(ru)待測樣本50μL；空白孔(kong)不(bu)加(jia)。

4．除空白孔(kong)外(wai)，標(biao)準品孔(kong)和(he)樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣(la)根(gen)過氧化物酶(mei)（HRP）標(biao)記的檢測抗體100μL，用封板膜(mo)封住反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育(yu)60min。

5．棄去液(ye)體，吸水(shui)紙上拍干，每孔(kong)加滿洗(xi)滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩去洗(xi)滌液(ye)，吸水(shui)紙上拍干，如(ru)此重(zhong)復洗(xi)板5次（也可(ke)用洗(xi)板機(ji)洗(xi)板）。

6．每(mei)孔加入(ru)底物A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7．每(mei)孔(kong)加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波長(chang)處測定各孔(kong)的OD值。

實驗結果計算：

繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線：在Excel工作表中，以標(biao)(biao)準(zhun)品濃度作橫坐標(biao)(biao)，對應OD值(zhi)作縱(zong)坐標(biao)(biao)，繪制出標(biao)(biao)準(zhun)品線性回(hui)歸曲(qu)線，按(an)曲(qu)線方程計算(suan)各樣(yang)本濃度值(zhi)。

（此圖僅供(gong)參考）

大(da)鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)ELISA試劑盒性能：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢測(ce)濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其(qi)它可溶性結構類似物交叉反應。

4.重(zhong)復性：板(ban)內(nei)變(bian)異系數(shu)小于(yu)10% ，板(ban)間變(bian)異系數(shu)小于(yu)15% 。

技術小(xiao)提示：

1.當混合(he)或重溶(rong)蛋(dan)白溶(rong)液(ye)時，盡(jin)量避(bi)免(mian)起沫。

2.為了避免(mian)交(jiao)叉感(gan)染(ran)，配置不(bu)同(tong)濃度(du)標準品、上樣、加不(bu)同(tong)試(shi)劑都需要更換槍頭(tou)。另外不(bu)同(tong)試(shi)劑請(qing)分別使用不(bu)同(tong)的移液槽。

3.每次(ci)孵育時，請正確使用封板膠可(ke)保證結果的準確性。

4.混合后(hou)的顯色(se)底(di)物在上(shang)板(ban)前應為無色(se)，請避光保存；假如微孔板(ban)后(hou)，將由物色(se)變成不同深(shen)度的藍(lan)色(se)。

5.終止液(ye)上(shang)板順序應同(tong)顯色底物上(shang)板順序一致(zhi)；加入終止液(ye)后，孔(kong)內(nei)(nei)顏色由藍變(bian)黃；若孔(kong)內(nei)(nei)有綠(lv)色，則表明(ming)孔(kong)內(nei)(nei)液(ye)體未混(hun)勻；請充(chong)分(fen)混(hun)合(he)。

說明：

1.由(you)于現(xian)有條件及科學技術(shu)水(shui)平尚不能對所有供貨商提(ti)供的所有原料(liao)進行全面的鑒定(ding)與分(fen)析，本產(chan)品(pin)可能存在一定(ding)的質(zhi)量技術(shu)風險(xian)。

2.實驗結果與試劑(ji)的(de)有效性(xing)、實驗者的(de)相(xiang)關操作以及(ji)當時的(de)實驗環境(jing)密(mi)切相(xiang)關，請務(wu)必(bi)準備(bei)充足的(de)標本備(bei)份。

3.不同批次的同一產品(pin)可能(neng)會有(you)少許差別(bie)，如：檢測(ce)限、靈敏度(du)以及顯色(se)時間等，請(qing)依據試(shi)劑盒內說明(ming)書(shu)進(jin)行實驗操作，網(wang)站電子版說明(ming)書(shu)僅作參考。

4.只有(you)全(quan)部(bu)使用(yong)本(ben)試(shi)劑盒配套(tao)試(shi)劑才(cai)能保證(zheng)檢(jian)測效果，不能混用(yong)其他制造商(shang)的(de)(de)產品。只有(you)嚴格遵守(shou)本(ben)試(shi)劑盒的(de)(de)實(shi)驗說明才(cai)會得(de)到(dao)檢(jian)測結果。