本(ben)試(shi)劑盒僅供體外研(yan)究使用，不用于臨床診斷

本試劑(ji)盒(he)用于體外定(ding)量(liang)檢測血清(qing)、血漿、組織(zhi)勻漿及相關液體樣本中小鼠(shu)ATP結合盒(he)轉運蛋白A5(ABCA5)的含量(liang)。

有效(xiao)期：6個月

保存條件：2-8℃

小(xiao)鼠ATP結合(he)盒(he)(he)轉(zhuan)運蛋白(bai)A5(ABCA5)ELISA試劑(ji)盒(he)(he)組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后(hou)請(qing)及時(shi)檢查所(suo)有(you)物(wu)品是否齊(qi)全(quan)。

2. 標準品濃度依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正(zheng)常(chang)標(biao)(biao)(biao)本(ben)(ben)(ben)檢(jian)驗(yan)(yan)，標(biao)(biao)(biao)本(ben)(ben)(ben)的正(zheng)常(chang)濃度值(zhi)均在試劑盒提供的檢(jian)測范圍內，實(shi)驗(yan)(yan)過程中直接取(qu)50μL樣(yang)本(ben)(ben)(ben)上樣(yang)即可。當有部分樣(yang)本(ben)(ben)(ben)值(zhi)超(chao)過標(biao)(biao)(biao)準品濃度時，可用樣(yang)本(ben)(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)液將標(biao)(biao)(biao)本(ben)(ben)(ben)進行(xing)適(shi)當稀(xi)釋(shi)后再進行(xing)實(shi)驗(yan)(yan)。

檢測(ce)前(qian)準備工(gong)作：

1.請(qing)提前(qian)20分鐘(zhong)從冰(bing)箱中取出試劑盒，平衡至室溫(wen)。

2.從(cong)冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶(jing)(jing)，屬于正常現象；放置室溫，輕搖均(jun)勻，待結晶(jing)(jing)溶解后再(zai)配(pei)置洗滌液。可將20ml濃縮洗滌液用蒸餾水(shui)或去離子水(shui)稀釋配(pei)置成400ml工作濃度的洗滌液，未(wei)用完的放回(hui)4℃

3.20×洗(xi)滌(di)緩沖(chong)(chong)液的稀(xi)釋(shi)：蒸餾水按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份(fen)20×洗(xi)滌(di)緩沖(chong)(chong)液加19份(fen)蒸餾水。

實驗原理：

試劑盒(he)采用(yong)雙(shuang)抗(kang)體(ti)一步(bu)夾心法酶(mei)聯免疫吸附(fu)試驗（ELISA）。往預(yu)先包被小(xiao)鼠ATP結合盒(he)轉(zhuan)運蛋白A5(ABCA5)捕(bu)獲抗(kang)體(ti)的包被微孔(kong)中(zhong)，依次(ci)加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗(kang)體(ti)，經過(guo)溫育并(bing)洗滌(di)。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在過(guo)氧化物酶(mei)的催(cui)化下轉(zhuan)化成(cheng)藍(lan)色(se)，并(bing)在酸的作(zuo)用(yong)下轉(zhuan)化成(cheng)黃色(se)。顏色(se)的深(shen)淺(qian)和樣品中(zhong)的小(xiao)鼠ATP結合盒(he)轉(zhuan)運蛋白A5(ABCA5)呈(cheng)正相關。用(yong)酶(mei)標儀在450nm 波長下測定吸光度(du)（OD 值），計算樣品濃(nong)度(du)。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶(mei)標(biao)儀（450nm）

2.高(gao)精度(du)加樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或(huo)去離子(zi)水

樣(yang)本(ben)處理及要(yao)求：

1.血(xue)清：將收集于血(xue)清分(fen)離(li)管的全(quan)血(xue)標本(ben)在(zai)室溫(wen)放置2小時或4℃過(guo)夜，然后(hou)1000×g離(li)心20 分(fen)鐘，取上(shang)清即可，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。

2.血漿(jiang)：用EDTA或(huo)肝(gan)素作為抗凝劑采集(ji)標(biao)(biao)本，并將(jiang)標(biao)(biao)本在采集(ji)后的30分鐘(zhong)內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清即可檢測，或(huo)將(jiang)上清置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong)。

3.組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)勻漿(jiang)：用預(yu)冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)，去除殘留(liu)血液（勻漿(jiang)中(zhong)(zhong)裂解(jie)的(de)紅細胞會影(ying)響(xiang)測量結果），稱(cheng)重后(hou)將(jiang)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)剪碎(sui)(sui)。將(jiang)剪碎(sui)(sui)的(de)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)與對(dui)應(ying)體積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重量體積比，比如1g的(de)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)樣品對(dui)應(ying)9mL的(de)PBS，具體體積可根據(ju)實驗需(xu)要適當調(diao)整，并(bing)做好(hao)記錄。推薦在PBS中(zhong)(zhong)加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃(li)勻漿(jiang)器中(zhong)(zhong)，于冰上充(chong)分(fen)(fen)研磨。為(wei)了進一步裂解(jie)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)細胞，可以對(dui)勻漿(jiang)液進行超聲(sheng)破碎(sui)(sui)，或反復凍融。最后(hou)將(jiang)勻漿(jiang)液于5000×g離心5~10分(fen)(fen)鐘(zhong)，取上清檢測。

4.細胞培養物(wu)上(shang)清：請1000×g離心20分鐘，取上(shang)清即可檢測，或將(jiang)上(shang)清置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。

5.其它生物標本(ben)：1000×g離心(xin)20分鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢測(ce)。

6.樣品外(wai)觀(guan)：樣品應(ying)(ying)清澈透明，懸浮(fu)物應(ying)(ying)離心去除。

7.樣(yang)(yang)品(pin)保存(cun)：樣(yang)(yang)品(pin)收集后若在1周內進行檢測(ce)的(de)可保存(cun)于4℃，若不(bu)能及時(shi)檢測(ce)，請按(an)一次(ci)使用量分(fen)裝，凍(dong)(dong)存(cun)于-20℃（1個月(yue)內檢測(ce)），或-80℃（6個月(yue)內檢測(ce)），避免反復凍(dong)(dong)融，標(biao)本溶血會影響檢測(ce)結果，因此(ci)溶血標(biao)本不(bu)宜進行此(ci)項檢測(ce)。

注意事項：

1.嚴格按照規定(ding)的時(shi)間和(he)溫度(du)進行溫育以保(bao)(bao)證準確結果。所(suo)有試劑都必須在使(shi)用前達到室溫20-25℃。使(shi)用后(hou)立即冷藏(zang)保(bao)(bao)存試劑。

2.洗板不(bu)正確(que)可以導致不(bu)準(zhun)確(que)的結(jie)果。在加(jia)入底物(wu)前確(que)保盡量吸干孔內液(ye)體。溫育過(guo)程中不(bu)要(yao)讓微孔干燥掉(diao)。

3.消除板(ban)底殘留的液體和(he)手指(zhi)印，否則影(ying)響OD值。

4.底物顯色液應(ying)呈無色或很淺(qian)的(de)顏(yan)色，已(yi)經變藍的(de)底物液不(bu)能(neng)使用。

5.避(bi)免試劑和標本的交叉污染以(yi)免造(zao)成錯誤結果。

6.在儲存和(he)溫育時避免強光(guang)直接照射(she)。

7.平(ping)衡(heng)至室溫后再打(da)開密(mi)封(feng)袋以防水滴凝聚在冷板(ban)條(tiao)上(shang)。

8.任(ren)何(he)反應試(shi)劑不能(neng)接觸(chu)漂白溶劑或(huo)漂白溶劑所散發的強烈氣體。任(ren)何(he)漂白成分都會(hui)破壞試(shi)劑盒中反應試(shi)劑的生物活性。

9.不(bu)能(neng)使用過(guo)期產品。

10.如果可(ke)能傳(chuan)播疾病(bing)，所有的(de)樣品都(dou)應(ying)管理(li)好，按照規定的(de)程序處理(li)樣品和檢測裝(zhuang)置。

操(cao)作步(bu)驟：

1．從室溫平(ping)衡(heng)60min后(hou)的(de)鋁(lv)箔袋中取出所需板(ban)(ban)條，剩余(yu)板(ban)(ban)條用自封袋密封放回4℃。

2．設置標(biao)(biao)準品孔和樣(yang)本孔，標(biao)(biao)準品孔各加(jia)不同濃度的標(biao)(biao)準品50μL。

3．樣(yang)本(ben)孔(kong)中a加入待測(ce)樣(yang)本(ben)50μL；空白孔(kong)不加。

4．除(chu)空白孔外(wai)，標準品孔和樣本孔中每(mei)孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記(ji)的(de)檢測抗體100μL，用(yong)封板膜(mo)封住(zhu)反應(ying)孔，37℃水浴(yu)鍋(guo)或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5．棄去液(ye)體，吸水(shui)紙(zhi)上(shang)拍干(gan)，每(mei)孔加滿(man)洗滌液(ye)（350μL），靜(jing)置1min，甩去洗滌液(ye)，吸水(shui)紙(zhi)上(shang)拍干(gan)，如(ru)此重(zhong)復洗板5次（也可用洗板機(ji)洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內，在(zai)450nm波長處(chu)測定各(ge)孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制標(biao)準曲(qu)線(xian)：在(zai)Excel工作(zuo)(zuo)表中，以標(biao)準品濃(nong)(nong)度(du)作(zuo)(zuo)橫坐(zuo)標(biao)，對應OD值(zhi)作(zuo)(zuo)縱坐(zuo)標(biao)，繪制出標(biao)準品線(xian)性回歸(gui)曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方程計算各樣本濃(nong)(nong)度(du)值(zhi)。

（此圖僅供參(can)考）

小鼠ATP結合盒轉運蛋白A5(ABCA5)ELISA試劑盒性能：

1. 檢測范圍(wei)：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈(ling)敏度：檢測濃度小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結(jie)構類似物交叉(cha)反應。

4.重復性：板內(nei)變異(yi)系(xi)數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異(yi)系(xi)數小(xiao)于15% 。

技術小提(ti)示：

1.當混合或重溶蛋白溶液時(shi)，盡量避免起沫。

2.為了避免交叉感染，配(pei)置不(bu)同濃度(du)標準品、上樣、加不(bu)同試(shi)劑都需(xu)要更換槍(qiang)頭。另外不(bu)同試(shi)劑請分別使用不(bu)同的(de)移液槽(cao)。

3.每次孵育時，請正(zheng)確使用(yong)封(feng)板膠可(ke)保證(zheng)結(jie)果的準確性(xing)。

4.混合(he)后(hou)(hou)的顯色(se)(se)底(di)物在上板(ban)前應為無色(se)(se)，請避光保存；假如微孔板(ban)后(hou)(hou)，將由物色(se)(se)變成不(bu)同深度的藍(lan)色(se)(se)。

5.終止(zhi)液上(shang)板順(shun)(shun)序(xu)應(ying)同顯(xian)色底物上(shang)板順(shun)(shun)序(xu)一致；加入終止(zhi)液后，孔(kong)內顏(yan)色由藍變黃；若(ruo)孔(kong)內有(you)綠色，則表明孔(kong)內液體未混(hun)勻；請充分混(hun)合。

說明：

1.由于(yu)現(xian)有條件及科(ke)學技(ji)術(shu)水平尚不能對所有供貨(huo)商提供的所有原料進(jin)行全(quan)面的鑒(jian)定與分析，本產(chan)品可能存(cun)在一(yi)定的質(zhi)量技(ji)術(shu)風險。

2.實驗結果與(yu)試劑(ji)的(de)(de)(de)有效性(xing)、實驗者的(de)(de)(de)相(xiang)關操作(zuo)以及當時的(de)(de)(de)實驗環境密切相(xiang)關，請(qing)務必準備充足的(de)(de)(de)標本備份。

3.不同(tong)批次(ci)的同(tong)一產(chan)品可(ke)能會有(you)少許差別，如：檢(jian)測限、靈敏度以(yi)及顯色時間等，請依據(ju)試(shi)劑盒內說(shuo)明書(shu)進行實驗操作(zuo)，網(wang)站(zhan)電子(zi)版(ban)說(shuo)明書(shu)僅作(zuo)參考。

4.只有全部使用(yong)本試劑(ji)(ji)盒(he)配套試劑(ji)(ji)才能(neng)保(bao)證(zheng)檢測(ce)效果，不能(neng)混用(yong)其他制(zhi)造商的(de)產品。只有嚴格遵守本試劑(ji)(ji)盒(he)的(de)實驗說明才會得到檢測(ce)結果。

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