本試劑盒僅供體(ti)外研究使(shi)用，不用于臨床診斷

本(ben)(ben)試劑(ji)盒用于體外定量檢測血(xue)清、血(xue)漿(jiang)、組織勻漿(jiang)及相關(guan)液體樣本(ben)(ben)中大鼠(shu)A-1-微球(qiu)蛋白(bai)/bikunin 前體蛋白(bai)(AMBP) 的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

大鼠A-1-微球蛋白bikunin 前體蛋白(AMBP)ELISA試(shi)劑盒組成：

備注(zhu)：

1.（96T/48T）打開(kai)包裝后請及時檢(jian)查所有(you)物品是否齊全。

2. 標準(zhun)品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過(guo)大量正常(chang)標(biao)本(ben)檢(jian)驗，標(biao)本(ben)的正常(chang)濃(nong)度值(zhi)均在試劑(ji)盒提(ti)供的檢(jian)測范圍內(nei)，實(shi)驗過(guo)程中直接取50μL樣本(ben)上樣即可。當有部分樣本(ben)值(zhi)超過(guo)標(biao)準品(pin)濃(nong)度時，可用樣本(ben)稀釋(shi)液(ye)將標(biao)本(ben)進行(xing)適當稀釋(shi)后再進行(xing)實(shi)驗。

檢測前準備工作：

1.請提前(qian)20分鐘從冰箱(xiang)中取(qu)出(chu)試劑盒，平衡(heng)至(zhi)室溫。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌(di)液可能有結(jie)晶，屬于(yu)正常現象；放置室溫，輕搖均勻，待結(jie)晶溶(rong)解后(hou)再配(pei)置洗滌(di)液。可將20ml濃縮洗滌(di)液用蒸餾(liu)水或去離子水稀釋配(pei)置成(cheng)400ml工作濃度的洗滌(di)液，未(wei)用完(wan)的放回(hui)4℃

3.20×洗滌緩沖液的(de)稀釋(shi)：蒸餾(liu)水(shui)按1：20稀釋(shi)，即1份20×洗滌緩沖液加(jia)19份蒸餾(liu)水(shui)。

實驗原理：

試(shi)劑(ji)盒采用(yong)(yong)雙(shuang)抗(kang)(kang)體一步夾心(xin)法(fa)酶(mei)聯免疫(yi)吸(xi)附試(shi)驗(yan)（ELISA）。往預先包被(bei)大鼠A-1-微球蛋(dan)白(bai)/bikunin 前體蛋(dan)白(bai)(AMBP) 捕獲抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)包被(bei)微孔中(zhong)，依次加入標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)檢(jian)測抗(kang)(kang)體，經過溫(wen)育并洗(xi)滌。用(yong)(yong)底物TMB顯色，TMB在過氧化(hua)(hua)物酶(mei)的(de)(de)(de)催化(hua)(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)成藍色，并在酸的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)下(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)成黃色。顏色的(de)(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)大鼠A-1-微球蛋(dan)白(bai)/bikunin 前體蛋(dan)白(bai)(AMBP) 呈正相關。用(yong)(yong)酶(mei)標(biao)儀在450nm 波(bo)長下(xia)測定吸(xi)光度（OD 值），計算樣(yang)品(pin)濃度。

實驗(yan)所(suo)需(xu)自備試驗(yan)器(qi)材(cai)：

1.酶(mei)標(biao)儀（450nm）

2.高精度加樣(yang)器及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或(huo)去離子水

樣(yang)本處理及(ji)要求(qiu)：

1.血(xue)清(qing)：將收集于(yu)血(xue)清(qing)分離管的全血(xue)標本(ben)在室(shi)溫放置2小(xiao)時或(huo)4℃過夜(ye)，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)(shang)清(qing)即可(ke)，或(huo)將上(shang)(shang)清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.血漿(jiang)：用EDTA或肝素(su)作為抗凝(ning)劑采(cai)集標(biao)本(ben)，并將標(biao)本(ben)在采(cai)集后的30分(fen)鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取上清(qing)即(ji)可檢測，或將上清(qing)置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免(mian)反(fan)復凍融。

3.組織(zhi)(zhi)(zhi)勻(yun)(yun)漿(jiang)：用(yong)預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)(zhi)(zhi)，去除殘留血液(ye)（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂解的(de)紅(hong)細胞會影響測(ce)量結果），稱重(zhong)后(hou)將組織(zhi)(zhi)(zhi)剪碎。將剪碎的(de)組織(zhi)(zhi)(zhi)與對(dui)應體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重(zhong)量體(ti)積比(bi)，比(bi)如1g的(de)組織(zhi)(zhi)(zhi)樣品對(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可(ke)(ke)根據實驗(yan)需要(yao)適當調整(zheng)，并做好(hao)記錄(lu)。推薦在(zai)PBS中加入(ru)蛋(dan)白酶抑(yi)制劑）加入(ru)玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器中，于冰(bing)上充分(fen)(fen)研(yan)磨。為(wei)了進(jin)一步(bu)裂解組織(zhi)(zhi)(zhi)細胞，可(ke)(ke)以(yi)對(dui)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)進(jin)行(xing)超聲破碎，或反復凍融。將勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)于5000×g離(li)心(xin)5~10分(fen)(fen)鐘，取上清檢測(ce)。

4.細(xi)胞培養物上(shang)(shang)清：請(qing)1000×g離心20分鐘，取上(shang)(shang)清即可(ke)檢測，或將上(shang)(shang)清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融(rong)。

5.其它生物標本(ben)：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品外觀：樣品應清(qing)澈透明，懸浮(fu)物應離心去(qu)除。

7.樣品(pin)保存：樣品(pin)收集后若在1周(zhou)內進行檢(jian)測(ce)的可保存于(yu)4℃，若不能及時檢(jian)測(ce)，請按(an)一次使(shi)用量(liang)分(fen)裝，凍(dong)存于(yu)-20℃（1個月內檢(jian)測(ce)），或-80℃（6個月內檢(jian)測(ce)），避免(mian)反復凍(dong)融，標(biao)本溶(rong)血(xue)會影響檢(jian)測(ce)結果，因此(ci)溶(rong)血(xue)標(biao)本不宜進行此(ci)項(xiang)檢(jian)測(ce)。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時間和(he)溫度進行溫育以保(bao)證(zheng)準確結果。所有試(shi)劑(ji)都必須(xu)在使用前(qian)達到室溫20-25℃。使用后立即冷(leng)藏保(bao)存試(shi)劑(ji)。

2.洗(xi)板不(bu)正確可(ke)以導(dao)致不(bu)準確的結果。在加入底(di)物前(qian)確保盡(jin)量(liang)吸干(gan)孔(kong)(kong)內液(ye)體。溫育過程(cheng)中不(bu)要(yao)讓微孔(kong)(kong)干(gan)燥掉。

3.消除板(ban)底殘留的液體和手指(zhi)印，否則影響OD值。

4.底物顯色液應呈無色或(huo)很淺(qian)的(de)顏色，已經變藍(lan)的(de)底物液不能(neng)使用。

5.避免(mian)試劑和標本的交叉(cha)污染(ran)以免(mian)造成錯誤結果。

6.在儲(chu)存和溫育時(shi)避免(mian)強(qiang)光(guang)直接照射。

7.平(ping)衡至室溫后再打(da)開(kai)密封袋(dai)以防水(shui)滴(di)凝聚在冷板(ban)條(tiao)上。

8.任何反(fan)應(ying)試(shi)劑不能接觸漂白溶(rong)劑或漂白溶(rong)劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都(dou)會破壞(huai)試(shi)劑盒中反(fan)應(ying)試(shi)劑的生物活(huo)性。

9.不能使用過期(qi)產品(pin)。

10.如果可能傳播疾(ji)病，所有的樣(yang)品(pin)都應管理好，按照規定的程序(xu)處理樣(yang)品(pin)和檢測裝置。

大鼠A-1-微球(qiu)蛋白bikunin 前(qian)體蛋白(AMBP)ELISA試劑盒操作(zuo)步(bu)驟：

1．從室溫(wen)平衡60min后的鋁箔袋(dai)中取出所(suo)需板條，剩(sheng)余(yu)板條用(yong)自封(feng)袋(dai)密(mi)封(feng)放回4℃。

2．設置(zhi)標(biao)準品孔和樣本(ben)孔，標(biao)準品孔各(ge)加不同(tong)濃度的標(biao)準品50μL。

3．樣本孔(kong)(kong)中a加入待測(ce)樣本50μL；空(kong)白孔(kong)(kong)不加。

4．除(chu)空白孔外，標(biao)準品孔和(he)樣(yang)本孔中每孔加入辣根過氧化物(wu)酶（HRP）標(biao)記的檢測抗體100μL，用封(feng)板(ban)膜封(feng)住反應孔，37℃水浴鍋(guo)或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育(yu)60min。

5．棄(qi)去(qu)液體，吸水紙上拍(pai)干，每孔加滿洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液，吸水紙上拍(pai)干，如此重復洗(xi)(xi)(xi)板(ban)(ban)5次（也(ye)可(ke)用洗(xi)(xi)(xi)板(ban)(ban)機洗(xi)(xi)(xi)板(ban)(ban)）。

6．每孔(kong)加(jia)入底物A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7．每(mei)孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測定各(ge)孔的OD值。

實驗(yan)結(jie)果計算(suan)：

繪(hui)制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)：在Excel工作(zuo)表中，以標(biao)(biao)準(zhun)品濃度作(zuo)橫坐標(biao)(biao)，對應OD值(zhi)作(zuo)縱坐標(biao)(biao)，繪(hui)制出標(biao)(biao)準(zhun)品線(xian)性回歸(gui)曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方程計算各樣本濃度值(zhi)。

（此圖(tu)僅(jin)供(gong)參(can)考）

性(xing)能：

1. 檢(jian)測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈(ling)敏(min)度(du)：檢測(ce)濃度(du)小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它可溶性結構(gou)類似物交(jiao)叉反應。

4.重復性：板內(nei)變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。

技術(shu)小提示：

1.當混合或重溶蛋(dan)白溶液時(shi)，盡量(liang)避(bi)免起沫。

2.為了避(bi)免交叉感染，配(pei)置(zhi)不同濃(nong)度標準(zhun)品、上樣、加(jia)不同試劑都需要更換(huan)槍頭。另外(wai)不同試劑請分別使用(yong)不同的移液槽。

3.每次孵育時，請正確使用封(feng)板膠可保證結果(guo)的(de)準確性(xing)。

4.混(hun)合后的(de)顯(xian)色(se)(se)底物在上板(ban)前應為(wei)無色(se)(se)，請避光保存；假如微孔板(ban)后，將(jiang)由(you)物色(se)(se)變成不同(tong)深度的(de)藍色(se)(se)。

5.終(zhong)止液(ye)上板順序應同顯色底物上板順序一(yi)致；加入終(zhong)止液(ye)后，孔(kong)內顏色由藍變黃；若(ruo)孔(kong)內有綠(lv)色，則表明孔(kong)內液(ye)體未混(hun)勻；請充分混(hun)合(he)。

說明(ming)：

1.由(you)于現有(you)條件及科(ke)學(xue)技術(shu)水平尚不能(neng)對所有(you)供貨商提供的所有(you)原料進行全(quan)面的鑒定與分析，本產品可(ke)能(neng)存在一(yi)定的質(zhi)量技術(shu)風險。

2.實驗結(jie)果與試劑的(de)有效性(xing)、實驗者的(de)相(xiang)關操作以(yi)及(ji)當時(shi)的(de)實驗環境密切相(xiang)關，請務必準備充足的(de)標本備份。

3.不(bu)同批次(ci)的(de)同一產品可能會有(you)少許差(cha)別，如：檢測限、靈(ling)敏度(du)以及顯色時(shi)間等(deng)，請依據(ju)試劑盒內說明書進(jin)行實(shi)驗操作，網站電(dian)子版(ban)說明書僅作參(can)考。

4.只(zhi)(zhi)有(you)全部使用(yong)本試(shi)劑盒配套(tao)試(shi)劑才能(neng)保(bao)證檢(jian)測效果，不能(neng)混用(yong)其(qi)他制造(zao)商的產品。只(zhi)(zhi)有(you)嚴格遵守本試(shi)劑盒的實驗說(shuo)明才會得到檢(jian)測結果。