本試劑盒(he)僅供體外(wai)研究使用，不(bu)用于臨床(chuang)診斷

本試劑盒(he)用于體外定量檢測(ce)血(xue)清、血(xue)漿(jiang)、組織(zhi)勻漿(jiang)及相(xiang)關(guan)液體樣(yang)本中人Bcl-2相(xiang)關(guan)X蛋白(Bax)的含量。

有效期：6個月(yue)

保存條件：2-8℃

人Bcl-2相關X蛋白(Bax)ELISA試劑盒(he)組成：

備注(zhu)：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時(shi)檢(jian)查所有物(wu)品是否(fou)齊全。

2. 標(biao)準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正常標(biao)(biao)本(ben)(ben)檢(jian)驗，標(biao)(biao)本(ben)(ben)的(de)正常濃度值均在(zai)試劑盒提(ti)供的(de)檢(jian)測范圍內，實(shi)驗過程中(zhong)直(zhi)接取50μL樣本(ben)(ben)上(shang)樣即可。當有(you)部分樣本(ben)(ben)值超(chao)過標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)濃度時(shi)，可用樣本(ben)(ben)稀釋液將標(biao)(biao)本(ben)(ben)進行適當稀釋后再進行實(shi)驗。

檢(jian)測前準備(bei)工(gong)作：

1.請(qing)提前20分鐘從(cong)冰(bing)箱中取出試(shi)劑盒，平衡至室(shi)溫。

2.從冰(bing)箱中取出的濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)可能有結晶，屬于正常現象；放置室溫(wen)，輕搖均勻，待結晶溶解后再(zai)配(pei)置洗(xi)滌(di)液(ye)。可將20ml濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)用蒸餾(liu)水或去離子水稀釋配(pei)置成400ml工作(zuo)濃度的洗(xi)滌(di)液(ye)，未(wei)用完的放回(hui)4℃

3.20×洗滌緩沖液(ye)的稀釋：蒸餾水(shui)按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液(ye)加19份蒸餾水(shui)。

實驗原理：

試(shi)(shi)劑盒采用(yong)雙抗(kang)(kang)體一(yi)步夾心法酶聯免(mian)疫吸(xi)附試(shi)(shi)驗(yan)（ELISA）。往預先包(bao)被人(ren)Bcl-2相關(guan)X蛋(dan)白(bai)(Bax)捕(bu)獲(huo)抗(kang)(kang)體的(de)(de)包(bao)被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的(de)(de)檢測抗(kang)(kang)體，經過(guo)(guo)溫育并(bing)(bing)洗滌。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過(guo)(guo)氧化(hua)(hua)(hua)物酶的(de)(de)催化(hua)(hua)(hua)下轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)成藍色(se)，并(bing)(bing)在(zai)酸的(de)(de)作用(yong)下轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)成最終(zhong)的(de)(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)人(ren)Bcl-2相關(guan)X蛋(dan)白(bai)(Bax)呈(cheng)正相關(guan)。用(yong)酶標儀在(zai)450nm 波長(chang)下測定吸(xi)光度（OD 值），計算(suan)樣品濃(nong)度。

實驗(yan)所需自備試驗(yan)器(qi)材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度(du)加樣(yang)器(qi)及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱(xiang)

4.蒸餾水或去(qu)離子水

樣本(ben)處(chu)理及要求：

1.血(xue)清(qing)：將(jiang)收(shou)集于血(xue)清(qing)分離管的全血(xue)標本在室溫放置(zhi)2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即(ji)可，或將(jiang)上清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝素作為(wei)抗凝劑采集標本，并(bing)將標本在采集后(hou)的30分(fen)(fen)鐘(zhong)內于(yu)2-8℃ 1000×g離心(xin)15分(fen)(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將上(shang)清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避(bi)免反復凍融(rong)。

3.組織勻漿(jiang)：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(ye)（勻漿(jiang)中裂解的紅(hong)細胞(bao)會影響測量結果），稱重(zhong)(zhong)后將(jiang)(jiang)組織剪(jian)碎。將(jiang)(jiang)剪(jian)碎的組織與對應體積的PBS（一般(ban)按(an)1:9的重(zhong)(zhong)量體積比，比如1g的組織樣品(pin)對應9mL的PBS，具(ju)體體積可(ke)根據實驗(yan)需要適當調(diao)整，并做(zuo)好記錄。推薦在PBS中加(jia)入蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑）加(jia)入玻璃勻漿(jiang)器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞(bao)，可(ke)以(yi)對勻漿(jiang)液(ye)進行超(chao)聲(sheng)破碎，或反復(fu)凍融。最后將(jiang)(jiang)勻漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養物上(shang)清(qing)：請1000×g離(li)心(xin)20分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢測，或將(jiang)上(shang)清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

5.其(qi)它生物標(biao)本：1000×g離心(xin)20分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)即(ji)可檢測。

6.樣品外觀：樣品應清(qing)澈(che)透明，懸(xuan)浮物應離(li)心(xin)去除。

7.樣品保存(cun)：樣品收集后若在1周內(nei)進(jin)行檢(jian)(jian)測的可保存(cun)于(yu)4℃，若不(bu)能(neng)及時檢(jian)(jian)測，請(qing)按(an)一次使用量分裝，凍(dong)存(cun)于(yu)-20℃（1個月內(nei)檢(jian)(jian)測），或-80℃（6個月內(nei)檢(jian)(jian)測），避免反復凍(dong)融，標(biao)本(ben)溶血(xue)會影響檢(jian)(jian)測結(jie)果，因(yin)此(ci)溶血(xue)標(biao)本(ben)不(bu)宜(yi)進(jin)行此(ci)項檢(jian)(jian)測。

注意事項：

1.嚴格按照規定的時(shi)間和溫(wen)(wen)度進行溫(wen)(wen)育(yu)以保證(zheng)準確結果。所有(you)試(shi)劑都必須在使用前達(da)到(dao)室溫(wen)(wen)20-25℃。使用后立(li)即冷藏保存(cun)試(shi)劑。

2.洗板不(bu)正確(que)(que)可以(yi)導致不(bu)準(zhun)確(que)(que)的(de)結果。在加入底物前(qian)確(que)(que)保盡量吸干孔內(nei)液體。溫育過程中不(bu)要讓微孔干燥(zao)掉。

3.消除板底殘(can)留的液(ye)體和手指印，否(fou)則影響OD值(zhi)。

4.底(di)物顯色(se)液應呈無色(se)或(huo)很(hen)淺的(de)顏色(se)，已(yi)經變藍的(de)底(di)物液不能使用。

5.避(bi)免試劑(ji)和標(biao)本的(de)交叉(cha)污染以免造成(cheng)錯誤結果。

6.在儲存(cun)和溫育(yu)時(shi)避免強光直接照射。

7.平衡(heng)至室溫后再(zai)打開(kai)密封(feng)袋以防水(shui)滴凝聚在冷板條上。

8.任(ren)何(he)反(fan)應試(shi)劑(ji)不能接觸漂白溶劑(ji)或漂白溶劑(ji)所(suo)散發的(de)強烈氣體。任(ren)何(he)漂白成(cheng)分都會破壞試(shi)劑(ji)盒中反(fan)應試(shi)劑(ji)的(de)生物(wu)活(huo)性。

9.不(bu)能(neng)使用過期產品。

10.如(ru)果可能傳(chuan)播疾病，所有的(de)樣(yang)品都應管理好，按(an)照(zhao)規(gui)定的(de)程序處理樣(yang)品和檢測裝(zhuang)置。

操作步(bu)驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔(bo)袋中取出所需板(ban)條，剩余板(ban)條用自封袋密封放回4℃。

2．設置(zhi)標(biao)準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)準品孔(kong)各加不(bu)同濃度的標(biao)準品50μL。

3．樣(yang)本(ben)孔中a加入待測樣(yang)本(ben)50μL；空白孔不加。

4．除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過氧化物酶（HRP）標記的檢(jian)測(ce)抗體100μL，用封板膜(mo)封住反應孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋或(huo)恒溫箱(xiang)溫育60min。

5．棄(qi)去液體，吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍干，每孔加滿洗滌(di)(di)液（350μL），靜置1min，甩去洗滌(di)(di)液，吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍干，如此重(zhong)復洗板(ban)5次(ci)（也(ye)可用洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。

6．每孔加入底物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避光孵育15min。

7．每(mei)孔加入(ru)終(zhong)止液(ye)50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制標準(zhun)曲(qu)(qu)線(xian)：在(zai)Excel工作表中，以標準(zhun)品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準(zhun)品線(xian)性回(hui)歸曲(qu)(qu)線(xian)，按曲(qu)(qu)線(xian)方程計算各樣本濃度值。

（此(ci)圖僅供參考）

人Bcl-2相關(guan)X蛋白(Bax)ELISA試(shi)劑盒性能(neng)：

1. 檢測(ce)范圍(wei)：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢(jian)測濃度小于(yu)1.0 pg/mL。

3.特異(yi)性：不與其它可溶性結(jie)構類似(si)物交叉反應。

4.重復性：板內變異系數小(xiao)于(yu)10% ，板間變異系數小(xiao)于(yu)15% 。

技(ji)術小提示：

1.當(dang)混合或重溶(rong)(rong)蛋白溶(rong)(rong)液(ye)時，盡量避免起沫。

2.為了避免交叉感(gan)染，配(pei)置不(bu)(bu)同濃度(du)標準品、上樣(yang)、加不(bu)(bu)同試劑都(dou)需要(yao)更(geng)換槍頭。另外不(bu)(bu)同試劑請分別使用不(bu)(bu)同的移液槽。

3.每次孵(fu)育時，請正確(que)(que)使用封板(ban)膠可保證結果的準確(que)(que)性(xing)。

4.混合后的顯色(se)底物在上板前應為無色(se)，請避光保存；假如微孔板后，將由物色(se)變成不(bu)同深度(du)的藍色(se)。

5.終止液(ye)上(shang)板(ban)順序應同顯(xian)色底(di)物上(shang)板(ban)順序一致；加入(ru)終止液(ye)后，孔內(nei)顏色由藍變黃(huang)；若孔內(nei)有綠色，則表明孔內(nei)液(ye)體未混(hun)勻；請充分混(hun)合。

說明：

1.由于現有(you)條件(jian)及科學技術水平(ping)尚(shang)不能對(dui)所(suo)(suo)有(you)供(gong)(gong)貨商提供(gong)(gong)的(de)所(suo)(suo)有(you)原料進行全(quan)面(mian)的(de)鑒定與分(fen)析，本產品可能存在(zai)一定的(de)質量技術風險(xian)。

2.實(shi)驗結果與試劑的有(you)效(xiao)性、實(shi)驗者的相關(guan)(guan)操作以及當(dang)時的實(shi)驗環境密切相關(guan)(guan)，請務(wu)必準備充足的標(biao)本備份。

3.不同(tong)批次的同(tong)一產品可能會有少許差別，如(ru)：檢測限、靈(ling)敏度以及顯色時間等(deng)，請(qing)依據試劑(ji)盒內說(shuo)明書進行實驗操作，網站電子版說(shuo)明書僅作參考。

4.只有全部使用(yong)本試劑(ji)盒配(pei)套試劑(ji)才能保證檢測效果(guo)，不能混用(yong)其他(ta)制(zhi)造商的產(chan)品。只有嚴格遵(zun)守本試劑(ji)盒的實驗說(shuo)明才會得(de)到檢測結果(guo)。