本(ben)試(shi)劑盒僅供體外研(yan)究使(shi)用(yong)，不(bu)用(yong)于臨(lin)床診斷

本試劑(ji)盒(he)用(yong)于體外定量檢測血清、血漿(jiang)、組織勻漿(jiang)及(ji)相關液體樣本中雞皮質酮 (CORT)的含量。

有(you)效(xiao)期：6個(ge)月

保存條件：2-8℃

雞(ji)皮質酮 (CORT)ELISA試劑(ji)盒組成：

備(bei)注：

1.（96T/48T）打開包裝(zhuang)后請及時檢查所有物品(pin)是否齊(qi)全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正(zheng)常(chang)標(biao)(biao)本(ben)檢驗，標(biao)(biao)本(ben)的正(zheng)常(chang)濃(nong)度(du)值(zhi)均在試劑盒(he)提供的檢測范圍內，實(shi)驗過程中直接取50μL樣(yang)本(ben)上樣(yang)即可。當有(you)部分(fen)樣(yang)本(ben)值(zhi)超過標(biao)(biao)準品濃(nong)度(du)時，可用樣(yang)本(ben)稀釋液將標(biao)(biao)本(ben)進(jin)行(xing)(xing)適當稀釋后再(zai)進(jin)行(xing)(xing)實(shi)驗。

檢測前準備工作：

1.請提前20分鐘從(cong)冰箱中(zhong)取(qu)出(chu)試(shi)劑(ji)盒，平(ping)衡至室溫。

2.從冰(bing)箱中取出的濃(nong)縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)可能有結晶，屬于正(zheng)常現象；放(fang)置室溫，輕搖均勻，待結晶溶(rong)解后再配置洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)。可將20ml濃(nong)縮洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水或去離(li)子水稀釋配置成400ml工作濃(nong)度的洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)，未用(yong)完的放(fang)回4℃

3.20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)稀(xi)釋：蒸餾水按1：20稀(xi)釋，即1份20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液(ye)加19份蒸餾水。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體(ti)一步夾心(xin)法酶聯免疫吸(xi)附試驗(yan)（ELISA）。往預(yu)先包(bao)被(bei)雞皮(pi)質酮 (CORT)捕獲抗體(ti)的(de)包(bao)被(bei)微孔(kong)中，依次加入(ru)標(biao)本(ben)、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)檢測抗體(ti)，經過溫育并(bing)洗(xi)滌。用底物(wu)TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧化(hua)(hua)物(wu)酶的(de)催化(hua)(hua)下(xia)轉化(hua)(hua)成藍色(se)，并(bing)在酸的(de)作用下(xia)轉化(hua)(hua)成黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深(shen)淺和樣(yang)品(pin)中的(de)雞皮(pi)質酮 (CORT)呈正相關。用酶標(biao)儀在450nm 波長下(xia)測定吸(xi)光度(du)（OD 值），計(ji)算樣(yang)品(pin)濃度(du)。

實驗所需自備試驗器材(cai)：

1.酶標(biao)儀（450nm）

2.高精度(du)加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱(xiang)

4.蒸餾水或去(qu)離子水

樣本(ben)處理及要(yao)求：

1.血(xue)清：將收(shou)集于(yu)血(xue)清分離管(guan)的(de)全血(xue)標本(ben)在(zai)室溫放置(zhi)2小(xiao)時或(huo)4℃過夜，然(ran)后(hou)1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或(huo)將上清置(zhi)于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。

2.血(xue)漿(jiang)：用EDTA或肝素作為抗凝劑采(cai)(cai)集(ji)標(biao)本(ben)，并(bing)將標(biao)本(ben)在(zai)采(cai)(cai)集(ji)后的(de)30分(fen)鐘(zhong)內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置于(yu)-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍(dong)融。

3.組(zu)(zu)織勻漿(jiang)(jiang)(jiang)：用預冷(leng)的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織，去除殘留血液（勻漿(jiang)(jiang)(jiang)中裂解的紅細(xi)胞會影響測量結果），稱重后將組(zu)(zu)織剪碎(sui)。將剪碎(sui)的組(zu)(zu)織與對(dui)應體(ti)積(ji)的PBS（一(yi)般按1:9的重量體(ti)積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的組(zu)(zu)織樣品(pin)對(dui)應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可(ke)根據實驗需要適當調(diao)整，并(bing)做好記錄。推(tui)薦在PBS中加入(ru)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)）加入(ru)玻(bo)璃勻漿(jiang)(jiang)(jiang)器(qi)中，于冰(bing)上(shang)充分研(yan)磨。為了(le)進一(yi)步裂解組(zu)(zu)織細(xi)胞，可(ke)以對(dui)勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液進行超聲破(po)碎(sui)，或反復凍融。最(zui)后將勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液于5000×g離心5~10分鐘(zhong)，取上(shang)清檢(jian)測。

4.細(xi)胞培養物上清(qing)：請1000×g離(li)心20分鐘，取上清(qing)即(ji)可檢(jian)測(ce)，或(huo)將上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。

5.其它生物標本：1000×g離(li)心(xin)20分鐘，取上清即可檢測(ce)。

6.樣品(pin)外觀：樣品(pin)應清澈透明(ming)，懸浮物(wu)應離(li)心去(qu)除(chu)。

7.樣(yang)品(pin)保存(cun)：樣(yang)品(pin)收集(ji)后若在1周內進(jin)(jin)行檢(jian)(jian)測(ce)的可保存(cun)于(yu)4℃，若不(bu)能及時檢(jian)(jian)測(ce)，請按一次使(shi)用(yong)量分裝，凍存(cun)于(yu)-20℃（1個(ge)月(yue)內檢(jian)(jian)測(ce)），或-80℃（6個(ge)月(yue)內檢(jian)(jian)測(ce)），避免反復(fu)凍融，標本溶(rong)血會影響檢(jian)(jian)測(ce)結(jie)果，因此(ci)溶(rong)血標本不(bu)宜進(jin)(jin)行此(ci)項檢(jian)(jian)測(ce)。

注意(yi)事項：

1.嚴格按照規定的(de)時間和溫度進行溫育以保(bao)證準確結果。所有試(shi)(shi)劑都(dou)必(bi)須在(zai)使(shi)用前達(da)到室溫20-25℃。使(shi)用后立即冷藏(zang)保(bao)存試(shi)(shi)劑。

2.洗板(ban)不正(zheng)確(que)可以導致不準確(que)的(de)結果(guo)。在加入底物前確(que)保盡(jin)量(liang)吸干(gan)孔內液(ye)體。溫(wen)育過程中不要讓(rang)微(wei)孔干(gan)燥掉(diao)。

3.消(xiao)除板底殘留的液體和手指印，否則(ze)影響OD值。

4.底物顯色(se)液應呈無色(se)或很淺的顏色(se)，已(yi)經(jing)變藍的底物液不能使用(yong)。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果(guo)。

6.在儲(chu)存和溫育(yu)時避免強光直接照射。

7.平(ping)衡至室溫后再打開(kai)密封袋以防(fang)水滴凝聚在冷板條(tiao)上(shang)。

8.任何(he)(he)反應(ying)試劑(ji)不(bu)能接(jie)觸(chu)漂白溶(rong)劑(ji)或漂白溶(rong)劑(ji)所散發的強烈氣(qi)體。任何(he)(he)漂白成(cheng)分都會破壞(huai)試劑(ji)盒(he)中反應(ying)試劑(ji)的生物活性。

9.不能使用過期(qi)產(chan)品。

10.如(ru)果可能傳播(bo)疾病，所有的樣(yang)品(pin)都應管理好，按照規定(ding)的程序(xu)處理樣(yang)品(pin)和(he)檢(jian)測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡(heng)60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2．設置標(biao)準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)準品孔(kong)各加(jia)不同濃度的標(biao)準品50μL。

3．樣(yang)本孔中a加入待測(ce)樣(yang)本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本孔(kong)中(zhong)每孔(kong)加入(ru)辣根過氧化物(wu)酶（HRP）標記的檢測抗(kang)體(ti)100μL，用封板膜封住反(fan)應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍干(gan)，每孔(kong)加滿(man)洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干(gan)，如此(ci)重復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7．每孔加(jia)入(ru)終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在(zai)450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果(guo)計算：

繪制標準(zhun)曲(qu)線：在Excel工(gong)作表(biao)中，以標準(zhun)品濃(nong)度作橫坐標，對應OD值(zhi)作縱坐標，繪制出(chu)標準(zhun)品線性(xing)回歸曲(qu)線，按曲(qu)線方程計算各樣本濃(nong)度值(zhi)。

（此圖(tu)僅供參(can)考）

性能：

1. 檢(jian)測范圍(wei)：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異性(xing)：不與(yu)其它可(ke)溶性(xing)結構類似物交叉反(fan)應。

4.重復性：板內變(bian)異系數(shu)(shu)小于10% ，板間(jian)變(bian)異系數(shu)(shu)小于15% 。

雞皮(pi)質酮 (CORT)ELISA試劑盒技術小提示：

1.當混合或重溶蛋白溶液(ye)時，盡(jin)量避免起(qi)沫。

2.為了避免交叉感染，配置不同濃度標(biao)準品(pin)、上(shang)樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分(fen)別使(shi)用不同的移液槽。

3.每次孵育時，請正確使用(yong)封(feng)板膠可保(bao)證結果(guo)的準(zhun)確性。

4.混合后的顯色(se)(se)底物在上板前應為無色(se)(se)，請避光保存；假如(ru)微孔板后，將(jiang)由物色(se)(se)變成不同深度的藍色(se)(se)。

5.終止液(ye)(ye)上板順序(xu)(xu)應同顯色(se)底物上板順序(xu)(xu)一致；加入終止液(ye)(ye)后(hou)，孔內(nei)顏色(se)由藍變黃(huang)；若(ruo)孔內(nei)有(you)綠色(se)，則表明孔內(nei)液(ye)(ye)體未(wei)混勻；請充(chong)分混合。

說明：

1.由于現有條件及科學技術(shu)水平尚不能(neng)對所(suo)有供貨商提供的所(suo)有原(yuan)料進行(xing)全面的鑒定與(yu)分析，本(ben)產(chan)品可能(neng)存在一(yi)定的質量技術(shu)風險。

2.實(shi)(shi)驗(yan)結(jie)果與試劑的有效性(xing)、實(shi)(shi)驗(yan)者(zhe)的相關操作以及當時的實(shi)(shi)驗(yan)環境(jing)密(mi)切(qie)相關，請務必準備(bei)充(chong)足(zu)的標本備(bei)份。

3.不同(tong)批次(ci)的同(tong)一產(chan)品可能會有少(shao)許差別(bie)，如：檢(jian)測限、靈敏度(du)以及顯色時間等，請(qing)依(yi)據試劑(ji)盒內說(shuo)(shuo)明書(shu)進行(xing)實驗操作，網站電子版說(shuo)(shuo)明書(shu)僅作參考(kao)。

4.只有全部(bu)使(shi)用(yong)(yong)本試(shi)劑(ji)盒配套試(shi)劑(ji)才能保證檢測效果，不能混(hun)用(yong)(yong)其他(ta)制造(zao)商的產品(pin)。只有嚴格遵守本試(shi)劑(ji)盒的實驗說明(ming)才會得(de)到檢測結果。