本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床(chuang)診斷

本(ben)試劑(ji)盒用于體外定(ding)量檢測血(xue)清(qing)、血(xue)漿、組織勻漿及相關液體樣本(ben)中(zhong)大(da)鼠(shu)70kDa熱休克蛋(dan)白5/葡(pu)萄糖調節蛋(dan)白78(HSPA5/GRP-78)的含量。

有效期：6個月

保存(cun)條件：2-8℃

大(da)鼠(shu)70kDa熱休克蛋白5葡萄糖調節蛋白78(HSPA5GRP-78)ELISA試劑盒組成：

備(bei)注：

1.（96T/48T）打開包裝(zhuang)后請及時檢查所有物品是否齊全。

2. 標準品濃度依次(ci)為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過(guo)大(da)量正常標(biao)本(ben)檢驗(yan)(yan)，標(biao)本(ben)的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nei)，實驗(yan)(yan)過(guo)程中直接取(qu)50μL樣本(ben)上樣即可。當有(you)部分樣本(ben)值超過(guo)標(biao)準(zhun)品濃度時，可用樣本(ben)稀釋(shi)液將標(biao)本(ben)進行(xing)適(shi)當稀釋(shi)后再(zai)進行(xing)實驗(yan)(yan)。

檢(jian)測(ce)前準(zhun)備(bei)工作：

1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑(ji)盒(he)，平衡至室溫。

2.從冰箱中取出的(de)濃縮洗(xi)滌(di)(di)液可(ke)能有結晶(jing)(jing)，屬于正常(chang)現象；放(fang)置室溫(wen)，輕搖均(jun)勻(yun)，待結晶(jing)(jing)溶解后再(zai)配(pei)置洗(xi)滌(di)(di)液。可(ke)將20ml濃縮洗(xi)滌(di)(di)液用蒸餾水(shui)或去離子水(shui)稀(xi)釋配(pei)置成400ml工(gong)作濃度的(de)洗(xi)滌(di)(di)液，未用完(wan)的(de)放(fang)回4℃

3.20×洗(xi)滌緩沖(chong)液的稀(xi)釋：蒸餾(liu)水(shui)按1：20稀(xi)釋，即1份(fen)(fen)20×洗(xi)滌緩沖(chong)液加19份(fen)(fen)蒸餾(liu)水(shui)。

實驗原理：

試(shi)劑盒采(cai)用雙抗體一步夾心法酶聯免疫(yi)吸附試(shi)驗（ELISA）。往預先(xian)包被(bei)大鼠70kDa熱(re)休克蛋(dan)(dan)白5/葡萄糖調節蛋(dan)(dan)白78(HSPA5/GRP-78)捕獲抗體的(de)(de)包被(bei)微孔中，依次加入標(biao)(biao)本、標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)、HRP標(biao)(biao)記的(de)(de)檢(jian)測抗體，經過(guo)溫育并洗(xi)滌(di)。用底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過(guo)氧化(hua)(hua)物酶的(de)(de)催化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成藍(lan)色(se)，并在(zai)酸(suan)的(de)(de)作(zuo)用下轉化(hua)(hua)成黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)(pin)中的(de)(de)大鼠70kDa熱(re)休克蛋(dan)(dan)白5/葡萄糖調節蛋(dan)(dan)白78(HSPA5/GRP-78)呈正相(xiang)關(guan)。用酶標(biao)(biao)儀在(zai)450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣(yang)品(pin)(pin)濃(nong)度。

實(shi)驗(yan)所需(xu)自備試驗(yan)器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高(gao)精度加樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫(wen)箱

4.蒸餾水或去離子水

樣本處(chu)理及要求：

1.血(xue)清(qing)：將(jiang)收集于血(xue)清(qing)分離管的(de)全血(xue)標本在室溫放置(zhi)2小時或(huo)4℃過夜，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)清(qing)即可，或(huo)將(jiang)上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝素作為(wei)抗凝劑采集標本，并(bing)將(jiang)標本在采集后(hou)的30分鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢測，或(huo)將(jiang)上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.組織(zhi)勻漿：用預(yu)冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)，去除(chu)殘留血液（勻漿中裂解(jie)的(de)(de)紅細胞會影(ying)響測量結(jie)果），稱重后將(jiang)組織(zhi)剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)(de)組織(zhi)與對(dui)應(ying)(ying)體積的(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)重量體積比(bi)，比(bi)如1g的(de)(de)組織(zhi)樣品(pin)對(dui)應(ying)(ying)9mL的(de)(de)PBS，具體體積可根(gen)據實驗需要(yao)適當調整，并(bing)做好記錄。推薦在(zai)PBS中加入蛋(dan)白酶(mei)抑制劑）加入玻璃勻漿器(qi)中，于冰(bing)上充分(fen)研(yan)磨。為了進一步裂解(jie)組織(zhi)細胞，可以(yi)對(dui)勻漿液進行超聲破碎(sui)，或反(fan)復凍融。將(jiang)勻漿液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4.細(xi)胞培養物上清(qing)：請1000×g離心20分鐘，取上清(qing)即可檢測，或(huo)將上清(qing)置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但應(ying)避(bi)免(mian)反復凍融(rong)。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣(yang)品外觀(guan)：樣(yang)品應(ying)清澈透明，懸浮(fu)物應(ying)離心去除。

7.樣(yang)品保存：樣(yang)品收集后若在(zai)1周內進行(xing)檢(jian)(jian)測(ce)的可保存于(yu)4℃，若不能及時檢(jian)(jian)測(ce)，請按一次使用(yong)量分裝，凍(dong)存于(yu)-20℃（1個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)），或-80℃（6個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)），避(bi)免反復(fu)凍(dong)融，標(biao)本溶(rong)血會影(ying)響(xiang)檢(jian)(jian)測(ce)結果(guo)，因(yin)此溶(rong)血標(biao)本不宜進行(xing)此項檢(jian)(jian)測(ce)。

注意事項：

1.嚴格按照規定的(de)時間(jian)和(he)溫(wen)度進行溫(wen)育以保(bao)證準確結果(guo)。所(suo)有(you)試(shi)劑都必須在使(shi)用前達到室(shi)溫(wen)20-25℃。使(shi)用后(hou)立即冷藏(zang)保(bao)存試(shi)劑。

2.洗板(ban)不正(zheng)確(que)可以導致不準確(que)的結果。在加入(ru)底物前確(que)保盡量吸干(gan)孔(kong)內液(ye)體。溫(wen)育過程中不要讓微(wei)孔(kong)干(gan)燥掉。

3.消除板底殘留的(de)液體和手指印(yin)，否(fou)則影響OD值。

4.底物(wu)顯(xian)色液應呈無色或很淺(qian)的顏色，已(yi)經變藍(lan)的底物(wu)液不(bu)能使用。

5.避(bi)免試劑(ji)和(he)標本(ben)的交叉污染以免造(zao)成錯(cuo)誤結(jie)果。

6.在儲存和溫育時避免強光直接照(zhao)射。

7.平衡至室溫后再打(da)開密封袋(dai)以防水(shui)滴凝聚(ju)在冷板(ban)條上。

8.任(ren)何反應試劑(ji)不(bu)能接觸漂(piao)白溶(rong)劑(ji)或漂(piao)白溶(rong)劑(ji)所(suo)散發的強(qiang)烈氣體。任(ren)何漂(piao)白成(cheng)分(fen)都會破壞試劑(ji)盒中(zhong)反應試劑(ji)的生物活性。

9.不能使用過期產品。

10.如果可能傳播疾病(bing)，所有(you)的樣品都應(ying)管理好，按照規(gui)定的程序(xu)處(chu)理樣品和檢測(ce)裝置。

大鼠70kDa熱休(xiu)克蛋白(bai)5葡(pu)萄糖(tang)調節蛋白(bai)78(HSPA5GRP-78)ELISA試劑盒操作步(bu)驟：

1．從室溫平衡60min后的(de)鋁箔袋中取(qu)出(chu)所(suo)需板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2．設(she)置標(biao)準品(pin)孔(kong)(kong)和樣本(ben)孔(kong)(kong)，標(biao)準品(pin)孔(kong)(kong)各加不同濃度的標(biao)準品(pin)50μL。

3．樣本(ben)孔中(zhong)a加(jia)入待測樣本(ben)50μL；空白孔不加(jia)。

4．除空白孔外，標(biao)準(zhun)品孔和(he)樣本孔中每(mei)孔加入辣(la)根過氧化物酶（HRP）標(biao)記的檢測抗體100μL，用封(feng)(feng)板膜(mo)封(feng)(feng)住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體(ti)，吸(xi)水(shui)(shui)紙上拍(pai)干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸(xi)水(shui)(shui)紙上拍(pai)干，如此重復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6．每孔(kong)加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7．每孔加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長處(chu)測定(ding)各(ge)孔的OD值(zhi)。

實驗結果計算：

繪(hui)制標準曲線(xian)(xian)：在Excel工作(zuo)表中(zhong)，以(yi)標準品(pin)濃度作(zuo)橫坐標，對應(ying)OD值(zhi)作(zuo)縱坐標，繪(hui)制出(chu)標準品(pin)線(xian)(xian)性回(hui)歸曲線(xian)(xian)，按曲線(xian)(xian)方程計算各樣本濃度值(zhi)。

（此(ci)圖僅供參(can)考）

性(xing)能：

1. 檢(jian)測(ce)范(fan)圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏(min)度(du)(du)：檢測濃度(du)(du)小于(yu)1.0 pg/mL。

3.特異(yi)性：不與其它可溶性結構類似物交叉(cha)反應。

4.重復性：板(ban)內變異(yi)系(xi)數小(xiao)(xiao)于10% ，板(ban)間(jian)變異(yi)系(xi)數小(xiao)(xiao)于15% 。

技術小提示：

1.當混合或重溶(rong)蛋白(bai)溶(rong)液時，盡量避免(mian)起沫。

2.為(wei)了(le)避免(mian)交叉感染(ran)，配置不(bu)同(tong)濃度標準品、上樣、加不(bu)同(tong)試劑都需要更換槍頭(tou)。另外不(bu)同(tong)試劑請分(fen)別使用(yong)不(bu)同(tong)的移(yi)液槽。

3.每次孵育時，請正確(que)使用封板(ban)膠(jiao)可保(bao)證結果的(de)準確(que)性(xing)。

4.混合后的(de)顯色底(di)物在上板前應為無色，請避光保存；假如(ru)微孔板后，將由物色變(bian)成不同深度的(de)藍色。

5.終止液上板(ban)(ban)順(shun)序應同顯色底物上板(ban)(ban)順(shun)序一致；加(jia)入終止液后，孔內顏色由(you)藍(lan)變黃；若孔內有綠色，則表(biao)明孔內液體未混勻；請充分混合。

說明：

1.由(you)于(yu)現有(you)條(tiao)件及科學技(ji)術水平尚(shang)不能(neng)對所有(you)供貨商提供的所有(you)原(yuan)料進行全面(mian)的鑒定與分(fen)析，本產品可(ke)能(neng)存在一(yi)定的質量技(ji)術風險。

2.實驗(yan)(yan)(yan)結(jie)果與試劑(ji)的有效性、實驗(yan)(yan)(yan)者(zhe)的相關操作以(yi)及當時的實驗(yan)(yan)(yan)環境密切(qie)相關，請務必準備充足的標(biao)本(ben)備份(fen)。

3.不同批次的(de)同一產品可能(neng)會(hui)有(you)少(shao)許差(cha)別(bie)，如(ru)：檢測限、靈敏度(du)以(yi)及顯色時間等(deng)，請依據試劑盒(he)內說明書進行實驗操作，網站電子版說明書僅作參考。

4.只(zhi)有全(quan)部使(shi)用(yong)本(ben)試劑(ji)盒(he)配套(tao)試劑(ji)才(cai)能保證檢測(ce)效果，不能混(hun)用(yong)其他制造商的(de)產(chan)品。只(zhi)有嚴格遵守本(ben)試劑(ji)盒(he)的(de)實驗說明(ming)才(cai)會得(de)到檢測(ce)結(jie)果。