本試劑盒僅供體外研究使用(yong)，不用(yong)于臨床診斷

本(ben)試劑盒用于體(ti)外定量檢測(ce)血清、血漿、組(zu)織(zhi)勻漿及相關(guan)液(ye)體(ti)樣(yang)本(ben)中(zhong)雞骨鈣(gai)素(su)(OCN）的含(han)量。

有效(xiao)期：6個月(yue)

保存條件(jian)：2-8℃

雞(ji)骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒(he)組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時(shi)檢查所有物(wu)品是(shi)否(fou)齊(qi)全。

2. 標準品(pin)濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量(liang)正(zheng)常標本(ben)(ben)檢(jian)驗(yan)，標本(ben)(ben)的正(zheng)常濃(nong)度值均在試劑盒提供的檢(jian)測范圍內，實(shi)驗(yan)過程中(zhong)直接(jie)取50μL樣本(ben)(ben)上樣即可。當有(you)部分樣本(ben)(ben)值超過標準品濃(nong)度時(shi)，可用樣本(ben)(ben)稀釋液將標本(ben)(ben)進(jin)行適當稀釋后再(zai)進(jin)行實(shi)驗(yan)。

檢測前準備工作：

1.請(qing)提前20分鐘從冰箱中取(qu)出試(shi)劑(ji)盒，平(ping)衡(heng)至(zhi)室溫(wen)。

2.從冰箱(xiang)中取出(chu)的濃(nong)縮(suo)洗(xi)(xi)滌(di)液可能有結(jie)晶，屬于正(zheng)常現(xian)象；放置室溫，輕搖(yao)均勻，待結(jie)晶溶解(jie)后再配(pei)置洗(xi)(xi)滌(di)液。可將20ml濃(nong)縮(suo)洗(xi)(xi)滌(di)液用蒸餾水(shui)或去離(li)子水(shui)稀釋配(pei)置成(cheng)400ml工(gong)作濃(nong)度的洗(xi)(xi)滌(di)液，未(wei)用完的放回4℃

3.20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即(ji)1份20×洗(xi)滌緩(huan)沖(chong)液加(jia)19份蒸餾水。

實驗原理：

試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗體一(yi)步夾心法酶(mei)(mei)聯免疫吸附(fu)試驗(yan)（ELISA）。往預先包(bao)被雞骨鈣素(OCN）捕(bu)獲(huo)抗體的(de)包(bao)被微孔(kong)中(zhong)，依次加(jia)入標(biao)本(ben)、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)檢測(ce)抗體，經過(guo)溫育并洗滌。用(yong)底物(wu)TMB顯色(se)(se)，TMB在過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)(mei)的(de)催化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成藍色(se)(se)，并在酸的(de)作用(yong)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成最終的(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)深淺和樣品(pin)中(zhong)的(de)雞骨鈣素(OCN）呈正相關。用(yong)酶(mei)(mei)標(biao)儀在450nm 波長下(xia)測(ce)定吸光度（OD 值），計算樣品(pin)濃度。

實(shi)驗(yan)(yan)所需(xu)自備試驗(yan)(yan)器材：

1.酶標(biao)儀（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及(ji)槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離(li)子水(shui)

樣(yang)本處理及(ji)要求：

1.血(xue)清(qing)(qing)：將(jiang)收集于(yu)血(xue)清(qing)(qing)分離管的(de)全血(xue)標本在室溫放置(zhi)(zhi)2小時(shi)或4℃過夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘，取上(shang)清(qing)(qing)即可，或將(jiang)上(shang)清(qing)(qing)置(zhi)(zhi)于(yu)-20℃或-80℃保存，但(dan)應(ying)避(bi)免反(fan)復(fu)凍融(rong)。

2.血(xue)漿：用(yong)EDTA或(huo)肝素作(zuo)為抗凝(ning)劑采集標本，并將標本在采集后的30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取上清(qing)即(ji)可檢(jian)測，或(huo)將上清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避(bi)免反復(fu)凍融。

3.組(zu)(zu)織(zhi)勻漿(jiang)(jiang)：用預冷的(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織(zhi)，去除殘留血液(ye)(ye)（勻漿(jiang)(jiang)中裂解(jie)(jie)的(de)(de)(de)紅細(xi)胞會影響(xiang)測(ce)量(liang)結果(guo)），稱重后將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)與(yu)對(dui)應體(ti)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)(de)重量(liang)體(ti)積(ji)(ji)比，比如(ru)1g的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)樣品對(dui)應9mL的(de)(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)(ji)可根據實驗需(xu)要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑(yi)制劑）加入玻璃勻漿(jiang)(jiang)器(qi)中，于冰上充分研磨。為了進(jin)一步裂解(jie)(jie)組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)胞，可以對(dui)勻漿(jiang)(jiang)液(ye)(ye)進(jin)行(xing)超聲破(po)碎，或(huo)反復凍融。最后將(jiang)勻漿(jiang)(jiang)液(ye)(ye)于5000×g離心5~10分鐘(zhong)，取上清檢測(ce)。

4.細胞(bao)培養物上(shang)清：請1000×g離心20分鐘(zhong)，取上(shang)清即可檢測，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避(bi)免反復(fu)凍(dong)融(rong)。

5.其(qi)它生物(wu)標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品外觀：樣品應(ying)清澈透明，懸浮物應(ying)離心去除。

7.樣品保存：樣品收(shou)集后若在(zai)1周內進行檢測(ce)的可保存于(yu)4℃，若不能及時檢測(ce)，請按(an)一次(ci)使用量分裝，凍(dong)存于(yu)-20℃（1個(ge)月內檢測(ce)），或(huo)-80℃（6個(ge)月內檢測(ce)），避免反復凍(dong)融，標本(ben)溶血會影(ying)響最后檢測(ce)結(jie)果，因此溶血標本(ben)不宜進行此項檢測(ce)。

雞骨(gu)鈣(gai)素(OCN)ELISA試劑盒注意事項(xiang)：

1.嚴(yan)格按(an)照規(gui)定的時間和溫(wen)度進行溫(wen)育(yu)以保(bao)證準確結果(guo)。所有試劑都必須在使(shi)用(yong)前達到室溫(wen)20-25℃。使(shi)用(yong)后立(li)即冷藏(zang)保(bao)存試劑。

2.洗板不(bu)正確(que)(que)可以導致(zhi)不(bu)準確(que)(que)的結果。在(zai)加入(ru)底物前確(que)(que)保盡量吸干孔(kong)(kong)內液體(ti)。溫育過程(cheng)中不(bu)要(yao)讓微孔(kong)(kong)干燥掉(diao)。

3.消除板底(di)殘留的液體和手指(zhi)印，否則影響OD值。

4.底(di)物(wu)顯色液(ye)應呈無色或很(hen)淺(qian)的顏(yan)色，已經變藍的底(di)物(wu)液(ye)不(bu)能使(shi)用。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成(cheng)錯誤結果。

6.在儲(chu)存(cun)和溫育時避免強光(guang)直接照(zhao)射。

7.平衡至室溫(wen)后(hou)再打開密封袋(dai)以防水滴(di)凝聚(ju)在冷(leng)板(ban)條上。

8.任何反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)不(bu)能(neng)接觸(chu)漂(piao)白(bai)溶劑(ji)或漂(piao)白(bai)溶劑(ji)所散發的(de)強烈(lie)氣(qi)體(ti)。任何漂(piao)白(bai)成(cheng)分都會破(po)壞(huai)試(shi)劑(ji)盒(he)中反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物活(huo)性。

9.不能使用過期(qi)產品(pin)。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都(dou)應管理好，按(an)照規定的程序(xu)處理樣品和(he)檢(jian)測裝置。

操作步(bu)驟：

1．從室溫(wen)平衡60min后的鋁箔(bo)袋(dai)中取出所(suo)需板條，剩余(yu)板條用自(zi)封袋(dai)密(mi)封放回(hui)4℃。

2．設置標準(zhun)品(pin)孔和樣本孔，標準(zhun)品(pin)孔各加不同濃度的(de)標準(zhun)品(pin)50μL。

3．樣(yang)本孔(kong)中(zhong)a加(jia)(jia)入待測樣(yang)本50μL；空白孔(kong)不加(jia)(jia)。

4．除空(kong)白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)中每孔(kong)加(jia)入辣(la)根過氧化物酶（HRP）標記(ji)的檢測抗體100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應(ying)孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5．棄去液體，吸水紙上(shang)拍干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌(di)液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌(di)液，吸水紙上(shang)拍干(gan)，如此重復洗(xi)板(ban)5次（也可用洗(xi)板(ban)機洗(xi)板(ban)）。

6．每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避(bi)光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處(chu)測定各(ge)孔的(de)OD值。

實驗結果計(ji)算：

繪(hui)制標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)(xian)：在Excel工(gong)作(zuo)表中，以標(biao)準(zhun)品(pin)濃度作(zuo)橫坐標(biao)，對應OD值(zhi)作(zuo)縱坐標(biao)，繪(hui)制出(chu)標(biao)準(zhun)品(pin)線(xian)(xian)性回歸(gui)曲(qu)線(xian)(xian)，按曲(qu)線(xian)(xian)方程計(ji)算各樣本(ben)濃度值(zhi)。

（此圖僅(jin)供參考）

性能：

1. 檢測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏度(du)：檢測(ce)濃度(du)小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其它(ta)可溶性結構類似物(wu)交叉反應。

4.重復性：板(ban)(ban)內變(bian)異系(xi)數小于(yu)10% ，板(ban)(ban)間變(bian)異系(xi)數小于(yu)15% 。

技(ji)術(shu)小提示(shi)：

1.當混合或(huo)重溶蛋白溶液時，盡(jin)量避免(mian)起沫。

2.為(wei)了避免交叉感染(ran)，配置不(bu)同濃(nong)度標準品、上(shang)樣、加不(bu)同試(shi)劑都(dou)需要更(geng)換槍(qiang)頭。另外不(bu)同試(shi)劑請分別使(shi)用不(bu)同的移液槽。

3.每次孵育時(shi)，請正(zheng)確使用封板膠可保證結果的準確性。

4.混合后的顯色底物在上板前(qian)應為無(wu)色，請避光(guang)保存；假如微孔板后，將由物色變成不同(tong)深度的藍色。

5.終止液(ye)上板順序應同顯色(se)(se)底(di)物上板順序一致；加入(ru)終止液(ye)后，孔內顏(yan)色(se)(se)由(you)藍變黃；若孔內有綠(lv)色(se)(se)，則表明孔內液(ye)體未混勻；請充分混合。

說明：

1.由于現有(you)條件及科學技(ji)術(shu)水(shui)平尚不能對所有(you)供(gong)貨商提(ti)供(gong)的所有(you)原料進行(xing)全面的鑒(jian)定(ding)(ding)與分析，本產品可能存在一定(ding)(ding)的質量(liang)技(ji)術(shu)風險。

2.實(shi)(shi)驗結(jie)果(guo)與(yu)試劑(ji)的(de)有(you)效性、實(shi)(shi)驗者的(de)相(xiang)關(guan)操作(zuo)以及當時的(de)實(shi)(shi)驗環境密切(qie)相(xiang)關(guan)，請務必準(zhun)備充足的(de)標本備份。

3.不(bu)同批次(ci)的同一產品(pin)可能會(hui)有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯(xian)色時間等(deng)，請(qing)依據(ju)試(shi)劑(ji)盒(he)內說明書(shu)進行實驗(yan)操(cao)作(zuo)，網(wang)站(zhan)電(dian)子版(ban)說明書(shu)僅作(zuo)參考。

4.只有全部使用(yong)本試劑(ji)盒配套試劑(ji)才能保證(zheng)檢測(ce)效果(guo)，不(bu)能混(hun)用(yong)其他(ta)制造商的產品。只有嚴(yan)格遵守本試劑(ji)盒的實驗說明才會(hui)得(de)到檢測(ce)結果(guo)。