本試劑盒僅供體外研(yan)究(jiu)使(shi)用，不用于臨床(chuang)診斷

本試劑盒用(yong)于體外定量(liang)(liang)檢測血(xue)清、血(xue)漿、組織(zhi)勻漿及(ji)相(xiang)關液體樣本中小鼠Ⅵ型膠原α3(COL6a3)的含(han)量(liang)(liang)。

有(you)效期：6個月

保(bao)存條件：2-8℃

試劑盒組(zu)成(cheng)：

備(bei)注：

1.（96T/48T）打開(kai)包裝后請及時檢查所有(you)物(wu)品(pin)是否齊(qi)全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經(jing)過大(da)量正常標本檢(jian)驗(yan)，標本的(de)正常濃度(du)值(zhi)(zhi)均在試劑盒提供的(de)檢(jian)測范圍內(nei)，實驗(yan)過程(cheng)中直接取50μL樣(yang)本上樣(yang)即可。當有(you)部分樣(yang)本值(zhi)(zhi)超過標準品濃度(du)時，可用(yong)樣(yang)本稀釋(shi)液將標本進(jin)行(xing)適當稀釋(shi)后再進(jin)行(xing)實驗(yan)。

檢測前準備工作(zuo)：

1.請(qing)提前20分鐘從冰(bing)箱中(zhong)取出(chu)試(shi)劑盒，平(ping)衡至室(shi)溫。

2.從(cong)冰箱(xiang)中取(qu)出的濃(nong)縮(suo)洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)可能有結(jie)晶，屬于正常現象(xiang)；放(fang)置室溫，輕搖均勻(yun)，待結(jie)晶溶(rong)解(jie)后再配置洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)。可將(jiang)20ml濃(nong)縮(suo)洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)用(yong)蒸餾水或去離子(zi)水稀釋(shi)配置成400ml工作濃(nong)度的洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)，未用(yong)完的放(fang)回(hui)4℃

3.20×洗(xi)(xi)滌緩沖液(ye)的稀釋：蒸餾水(shui)按1：20稀釋，即1份(fen)20×洗(xi)(xi)滌緩沖液(ye)加19份(fen)蒸餾水(shui)。

實驗原理：

試劑盒采用雙(shuang)抗體一步夾心法酶(mei)(mei)(mei)聯免(mian)疫吸附試驗(yan)（ELISA）。往預先(xian)包被小(xiao)(xiao)鼠(shu)Ⅵ型膠原α3(COL6a3)捕獲抗體的(de)包被微孔中，依次加(jia)入標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)檢測抗體，經過溫育并(bing)洗滌。用底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧化物酶(mei)(mei)(mei)的(de)催化下轉化成藍色(se)，并(bing)在酸的(de)作用下轉化成黃色(se)。顏色(se)的(de)深淺和樣品(pin)中的(de)小(xiao)(xiao)鼠(shu)Ⅵ型膠原α3(COL6a3)呈正相關。用酶(mei)(mei)(mei)標(biao)儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度(du)（OD 值），計算樣品(pin)濃度(du)。

實(shi)驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水或(huo)去離子水

樣本處理及(ji)要求：

1.血(xue)清(qing)：將(jiang)收(shou)集于血(xue)清(qing)分離(li)管的全血(xue)標本在室溫放置2小時(shi)或(huo)4℃過(guo)夜，然后1000×g離(li)心20 分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)即可，或(huo)將(jiang)上(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。

2.血(xue)漿：用EDTA或(huo)(huo)肝素作為抗凝劑采(cai)集標本(ben)，并將標本(ben)在采(cai)集后的(de)30分鐘內于2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取上清即(ji)可檢測(ce)，或(huo)(huo)將上清置(zhi)于-20℃或(huo)(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

3.組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)勻漿：用預冷的(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)，去除殘留血液（勻漿中裂解的(de)(de)(de)紅細胞會影響測量(liang)結果），稱重后將(jiang)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)剪碎(sui)。將(jiang)剪碎(sui)的(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)與對應體積(ji)的(de)(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)(de)重量(liang)體積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)樣品對應9mL的(de)(de)(de)PBS，具(ju)體體積(ji)可根(gen)據實驗需要適當調整，并做(zuo)好記錄(lu)。推(tui)薦在(zai)PBS中加入(ru)(ru)蛋(dan)白酶抑制劑(ji)）加入(ru)(ru)玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨(mo)。為(wei)了(le)進一步裂解組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)細胞，可以(yi)對勻漿液進行超聲破碎(sui)，或(huo)反復凍融。將(jiang)勻漿液于5000×g離(li)心5~10分鐘，取(qu)上清檢測。

4.細(xi)胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘(zhong)，取上清即可檢測，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

5.其它生物標(biao)本：1000×g離心20分鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)即(ji)可檢測。

6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物(wu)應離心(xin)去除(chu)。

7.樣(yang)品保(bao)存(cun)(cun)：樣(yang)品收集后(hou)若(ruo)在1周內(nei)進行檢(jian)(jian)測的可保(bao)存(cun)(cun)于4℃，若(ruo)不(bu)能(neng)及時檢(jian)(jian)測，請按(an)一次(ci)使用量分裝，凍存(cun)(cun)于-20℃（1個月內(nei)檢(jian)(jian)測），或-80℃（6個月內(nei)檢(jian)(jian)測），避免反復(fu)凍融，標(biao)本溶血(xue)會影(ying)響檢(jian)(jian)測結(jie)果，因此溶血(xue)標(biao)本不(bu)宜進行此項檢(jian)(jian)測。

小鼠(shu)Ⅵ型膠原α3(COL6a3)ELISA試劑(ji)盒注意事項：

1.嚴(yan)格按照規定的時(shi)間和溫(wen)度進行溫(wen)育(yu)以保證準確結果(guo)。所有試劑都(dou)必須在使用(yong)前達到室溫(wen)20-25℃。使用(yong)后立即冷藏保存試劑。

2.洗板不正確(que)可以導致不準確(que)的結果。在(zai)加入底(di)物(wu)前確(que)保盡量吸干孔內液(ye)體。溫育(yu)過程中不要(yao)讓(rang)微孔干燥掉。

3.消除板底(di)殘留的(de)液體和手指印，否(fou)則(ze)影響OD值。

4.底(di)物顯(xian)色液應呈無色或(huo)很(hen)淺(qian)的(de)顏色，已經變藍的(de)底(di)物液不能使用(yong)。

5.避(bi)免試(shi)劑(ji)和(he)標(biao)本的交(jiao)叉污染以免造成錯誤結果。

6.在儲存和(he)溫育時避免強光直接照射。

7.平衡至(zhi)室(shi)溫后(hou)再打開密(mi)封袋以(yi)防水滴凝(ning)聚在冷板條上。

8.任(ren)何反(fan)應試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)不能接觸漂白溶(rong)劑(ji)(ji)(ji)或(huo)漂白溶(rong)劑(ji)(ji)(ji)所散發的強烈氣體。任(ren)何漂白成分都會破(po)壞試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒中(zhong)反(fan)應試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)的生物活性。

9.不能(neng)使用過期產(chan)品。

10.如果可(ke)能傳播疾(ji)病，所有的樣品都(dou)應(ying)管理好(hao)，按(an)照規定(ding)的程序處理樣品和(he)檢測裝置。

操作步驟：

1．從室溫平衡(heng)60min后的鋁(lv)箔袋(dai)中(zhong)取出所需板條，剩余板條用自封袋(dai)密封放回4℃。

2．設(she)置標準品(pin)孔和樣本孔，標準品(pin)孔各加不同濃度的標準品(pin)50μL。

3．樣(yang)本孔中a加(jia)入待測樣(yang)本50μL；空白(bai)孔不加(jia)。

4．除(chu)空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)中(zhong)每孔(kong)加(jia)入辣(la)根過(guo)氧化物酶(mei)（HRP）標記的檢(jian)測抗體100μL，用封板(ban)膜封住反應孔(kong)，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液(ye)體，吸(xi)水紙上拍干，每(mei)孔加滿洗滌液(ye)（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗滌液(ye)，吸(xi)水紙上拍干，如此(ci)重(zhong)復洗板(ban)5次（也(ye)可用(yong)洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。

6．每孔加入(ru)底物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止(zhi)液(ye)50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算：

繪制(zhi)標準(zhun)曲線(xian)：在(zai)Excel工作表中，以標準(zhun)品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制(zhi)出標準(zhun)品線(xian)性回(hui)歸曲線(xian)，按曲線(xian)方程計算各樣本濃度值。

（此圖僅供參考）

性能(neng)：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈(ling)敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異(yi)性：不與(yu)其它可溶性結(jie)構類似物交(jiao)叉反應。

4.重復性：板內變異系數(shu)(shu)小于10% ，板間變異系數(shu)(shu)小于15% 。

小鼠(shu)Ⅵ型膠(jiao)原α3(COL6a3)ELISA試劑盒技術(shu)小提(ti)示：

1.當混合或重溶蛋白溶液(ye)時，盡量避免起(qi)沫(mo)。

2.為了(le)避(bi)免交叉感(gan)染，配置不(bu)同(tong)濃(nong)度標準(zhun)品、上(shang)樣(yang)、加不(bu)同(tong)試劑(ji)都(dou)需要更換槍頭(tou)。另外(wai)不(bu)同(tong)試劑(ji)請分別使用不(bu)同(tong)的移液槽。

3.每次孵育(yu)時，請正確(que)使用封板膠(jiao)可保證結果的準(zhun)確(que)性。

4.混合后的顯(xian)色底物在上板前(qian)應為(wei)無色，請避光保存；假(jia)如(ru)微(wei)孔板后，將由物色變成不同深度的藍色。

5.終止(zhi)液(ye)上板順序(xu)應同顯色底物上板順序(xu)一致；加入終止(zhi)液(ye)后，孔內顏色由藍(lan)變黃；若(ruo)孔內有(you)綠(lv)色，則表(biao)明孔內液(ye)體未混勻(yun)；請(qing)充分混合。

說明：

1.由于現有條件及(ji)科學技術水平尚不能(neng)對(dui)所(suo)有供(gong)貨商提供(gong)的所(suo)有原料進行(xing)全(quan)面的鑒定與分析，本產品可能(neng)存在一定的質量技術風險。

2.實驗(yan)結果與試(shi)劑的有效(xiao)性、實驗(yan)者的相關操(cao)作(zuo)以(yi)及當(dang)時的實驗(yan)環境密切相關，請務必準備充足的標(biao)本備份(fen)。

3.不同批次的同一產品可能會有(you)少許差別，如：檢測限、靈敏(min)度以及顯(xian)色時間(jian)等，請依(yi)據試劑盒內說明書進行實驗(yan)操作，網(wang)站電(dian)子版說明書僅作參考。

4.只(zhi)有(you)全部使(shi)用(yong)本試(shi)劑(ji)盒(he)配套試(shi)劑(ji)才能(neng)保證檢測效果(guo)，不能(neng)混用(yong)其他制造商的(de)產品。只(zhi)有(you)嚴格(ge)遵守本試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)實驗說明(ming)才會得(de)到檢測結果(guo)。