本試劑盒僅供(gong)體外研究(jiu)使(shi)用，不(bu)用于臨床診斷(duan)

本試(shi)劑盒(he)用于體外定量(liang)檢測血(xue)清、血(xue)漿、組織勻漿及相(xiang)關液(ye)體樣本中人4-羥基壬烯醛(quan)(4-HNE)的含(han)量(liang)。

有效期：6個月

保存(cun)條件(jian)：2-8℃

人4-羥基壬烯醛(4-HNE)ELISA試劑盒(he)試劑盒(he)組成：

備(bei)注(zhu)：

1.（96T/48T）打開包(bao)裝后請及時檢查(cha)所有(you)物(wu)品(pin)是否齊全。

2. 標準品濃度(du)依次為(wei)：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大(da)量(liang)正常(chang)標本(ben)(ben)檢(jian)(jian)驗(yan)，標本(ben)(ben)的(de)正常(chang)濃度值均在試劑(ji)盒提供(gong)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)范圍內，實(shi)驗(yan)過程中(zhong)直接取50μL樣本(ben)(ben)上樣即可(ke)。當(dang)有部分樣本(ben)(ben)值超過最(zui)大(da)標準品濃度時，可(ke)用樣本(ben)(ben)稀釋(shi)液將標本(ben)(ben)進行適當(dang)稀釋(shi)后(hou)再進行實(shi)驗(yan)。

檢測(ce)前準備工作：

1.請(qing)提前20分鐘從冰箱中取(qu)出(chu)試劑盒，平衡(heng)至室溫(wen)。

2.從冰箱中取出的(de)(de)濃縮洗(xi)滌液(ye)可能有結(jie)晶(jing)，屬(shu)于正(zheng)常現(xian)象；放(fang)置(zhi)室溫，輕搖均(jun)勻，待結(jie)晶(jing)溶解(jie)后再配置(zhi)洗(xi)滌液(ye)。可將20ml濃縮洗(xi)滌液(ye)用蒸(zheng)餾(liu)水或(huo)去離子水稀釋配置(zhi)成(cheng)400ml工作濃度(du)的(de)(de)洗(xi)滌液(ye)，未用完的(de)(de)放(fang)回4℃

3.20×洗滌(di)緩(huan)沖(chong)液的稀(xi)(xi)釋：蒸餾水按(an)1：20稀(xi)(xi)釋，即1份(fen)20×洗滌(di)緩(huan)沖(chong)液加19份(fen)蒸餾水。

實驗(yan)原(yuan)理：

試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗(kang)(kang)體(ti)一步(bu)夾心法酶聯免(mian)疫吸(xi)附試驗（ELISA）。往預先包被人(ren)(ren)4-羥基壬烯醛(quan)(quan)(4-HNE)捕獲(huo)抗(kang)(kang)體(ti)的(de)包被微孔中，依(yi)次加入標(biao)(biao)本(ben)、標(biao)(biao)準品、HRP標(biao)(biao)記的(de)檢測(ce)抗(kang)(kang)體(ti)，經(jing)過溫育并洗滌。用(yong)底物TMB顯色(se)(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)(hua)(hua)物酶的(de)催化(hua)(hua)(hua)下(xia)(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)成藍(lan)色(se)(se)，并在(zai)酸的(de)作用(yong)下(xia)(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)成最終的(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)深(shen)淺(qian)和(he)樣品中的(de)人(ren)(ren)4-羥基壬烯醛(quan)(quan)(4-HNE)呈正(zheng)相(xiang)關。用(yong)酶標(biao)(biao)儀在(zai)450nm 波長下(xia)(xia)測(ce)定吸(xi)光度（OD 值），計算樣品濃度。

實驗所(suo)需自備試(shi)驗器材(cai)：

1.酶(mei)標儀（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)

樣本處理(li)及要求：

1.血清(qing)(qing)：將(jiang)收集于血清(qing)(qing)分(fen)離管的全(quan)血標本在室溫放(fang)置(zhi)2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分(fen)鐘，取上清(qing)(qing)即可，或將(jiang)上清(qing)(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍(dong)融。

2.血(xue)漿：用EDTA或肝素作為抗凝(ning)劑采(cai)集標(biao)本，并將標(biao)本在采(cai)集后的(de)30分鐘(zhong)內(nei)于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可檢測(ce)，或將上(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

3.組(zu)(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)(zu)織(zhi)，去除殘留血液(ye)（勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)中裂解(jie)的紅細胞會影響測量結果(guo)），稱重后將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的組(zu)(zu)織(zhi)與(yu)對應(ying)體(ti)積(ji)的PBS（一般按1:9的重量體(ti)積(ji)比，比如1g的組(zu)(zu)織(zhi)樣品(pin)對應(ying)9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根(gen)據(ju)實驗(yan)需(xu)要適當調整，并(bing)做好記錄。推(tui)薦在PBS中加入蛋白酶抑(yi)制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)器中，于冰上充分研磨。為(wei)了進(jin)(jin)一步(bu)裂解(jie)組(zu)(zu)織(zhi)細胞，可以(yi)對勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)液(ye)進(jin)(jin)行超聲破碎，或反復凍融。最(zui)后將(jiang)勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養物上(shang)(shang)清(qing)(qing)：請(qing)1000×g離心20分(fen)鐘，取(qu)上(shang)(shang)清(qing)(qing)即可檢(jian)測，或將上(shang)(shang)清(qing)(qing)置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

5.其它生(sheng)物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣(yang)品外觀：樣(yang)品應清澈透明，懸(xuan)浮物(wu)應離(li)心去除。

7.樣(yang)品保存(cun)：樣(yang)品收集后若在1周內(nei)進行(xing)檢(jian)測(ce)(ce)的可保存(cun)于4℃，若不能(neng)及時檢(jian)測(ce)(ce)，請按一次使用量分裝(zhuang)，凍(dong)存(cun)于-20℃（1個(ge)月(yue)內(nei)檢(jian)測(ce)(ce)），或(huo)-80℃（6個(ge)月(yue)內(nei)檢(jian)測(ce)(ce)），避免(mian)反復凍(dong)融，標本(ben)溶(rong)血會影響最(zui)后檢(jian)測(ce)(ce)結果，因此溶(rong)血標本(ben)不宜進行(xing)此項檢(jian)測(ce)(ce)。

人4-羥基壬(ren)烯醛(4-HNE)ELISA試劑盒注(zhu)意事項：

1.嚴格按照(zhao)規(gui)定的時間和溫(wen)度進行溫(wen)育以保(bao)(bao)證準(zhun)確結(jie)果。所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都必須(xu)在使(shi)用(yong)前達(da)到室(shi)溫(wen)20-25℃。使(shi)用(yong)后立即冷藏(zang)保(bao)(bao)存試(shi)劑(ji)。

2.洗(xi)板(ban)不正確可(ke)以(yi)導致不準確的(de)結果(guo)。在加入底物前(qian)確保盡量(liang)吸(xi)干(gan)孔內液體。溫(wen)育過(guo)程中不要讓微孔干(gan)燥掉。

3.消除(chu)板底殘留(liu)的液(ye)體和手指印，否(fou)則影響OD值(zhi)。

4.底物顯色液(ye)(ye)應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液(ye)(ye)不能使(shi)用。

5.避(bi)免(mian)試劑(ji)和標本的交叉污染以免(mian)造成錯誤結果。

6.在(zai)儲存和溫育時(shi)避免強光直(zhi)接(jie)照射(she)。

7.平衡至室溫后再(zai)打開密封(feng)袋以防水(shui)滴凝聚在(zai)冷板條(tiao)上。

8.任何反應試(shi)劑(ji)(ji)不能接觸漂(piao)(piao)白溶(rong)劑(ji)(ji)或漂(piao)(piao)白溶(rong)劑(ji)(ji)所(suo)散發的(de)(de)強烈氣體。任何漂(piao)(piao)白成分都會破壞試(shi)劑(ji)(ji)盒中反應試(shi)劑(ji)(ji)的(de)(de)生(sheng)物活性。

9.不能使(shi)用過期產品(pin)。

10.如(ru)果(guo)可能傳播疾(ji)病(bing)，所有的(de)樣品(pin)都應管理(li)好，按(an)照規(gui)定的(de)程序處理(li)樣品(pin)和檢測(ce)裝置。

操(cao)作(zuo)步驟：

1．從室溫平(ping)衡60min后的(de)鋁箔袋(dai)中(zhong)取出所需(xu)板條(tiao)(tiao)，剩余板條(tiao)(tiao)用(yong)自封(feng)袋(dai)密封(feng)放(fang)回4℃。

2．設置標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)孔和樣本孔，標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)孔各加(jia)不同濃度的標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)50μL。

3．樣本孔中(zhong)a加(jia)入待測樣本50μL；空白(bai)孔不加(jia)。

4．除(chu)空白孔(kong)外，標準品(pin)孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過氧化物酶(mei)（HRP）標記的檢測抗體100μL，用(yong)封(feng)(feng)板膜封(feng)(feng)住反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒(heng)溫箱溫育60min。

5．棄(qi)去(qu)液體，吸(xi)水(shui)(shui)紙上拍干(gan)，每孔加(jia)滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗滌液，吸(xi)水(shui)(shui)紙上拍干(gan)，如(ru)此(ci)重(zhong)復(fu)洗板5次(ci)（也可用洗板機(ji)洗板）。

6．每孔加(jia)入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止(zhi)液50μL，15min內，在(zai)450nm波長處測定各孔的(de)OD值。

實驗結果計(ji)算：

繪(hui)制標準曲(qu)線(xian)：在Excel工作(zuo)表(biao)中，以標準品濃度(du)作(zuo)橫坐標，對應OD值作(zuo)縱(zong)坐標，繪(hui)制出標準品線(xian)性(xing)回(hui)歸(gui)曲(qu)線(xian)，按曲(qu)線(xian)方(fang)程計算各樣本濃度(du)值。

（此圖僅供參考(kao)）

性能：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3. 特異性：不與其(qi)它可溶性結(jie)構類似物交叉反應(ying)。

4. 重(zhong)復性：板內變(bian)異系數(shu)小(xiao)于10% ，板間變(bian)異系數(shu)小(xiao)于15% 。

技術小提(ti)示(shi)：

1. 當混(hun)合或重溶(rong)蛋(dan)白溶(rong)液時，盡量避(bi)免起沫(mo)。

2. 為了(le)避(bi)免交叉(cha)感染，配置(zhi)不(bu)同(tong)濃度標準品、上樣、加(jia)不(bu)同(tong)試(shi)劑(ji)都需(xu)要(yao)更換槍頭。另外不(bu)同(tong)試(shi)劑(ji)請分別使(shi)用不(bu)同(tong)的(de)移液槽。

3. 每次孵育時(shi)，請正確使用封板膠可(ke)保證結(jie)果(guo)的準(zhun)確性。

4. 混合后的(de)顯色(se)底(di)物在上板(ban)前(qian)應(ying)為無色(se)，請(qing)避光保存；假(jia)如(ru)微孔板(ban)后，將由(you)物色(se)變成不同(tong)深度的(de)藍色(se)。

5. 終(zhong)止(zhi)液(ye)上板順序(xu)應同顯色底物上板順序(xu)一致；加入終(zhong)止(zhi)液(ye)后，孔內顏色由藍變黃；若孔內有(you)綠色，則表明(ming)孔內液(ye)體未混勻；請充(chong)分混合。

說明：

1. 由于現有(you)條件及(ji)科學技術水(shui)平尚不(bu)能(neng)對所(suo)(suo)有(you)供貨商提供的所(suo)(suo)有(you)原料(liao)進行(xing)全面(mian)的鑒定與分析，本產(chan)品可能(neng)存在一(yi)定的質(zhi)量技術風險。

2. 最終的實(shi)驗結果與試(shi)劑的有效性、實(shi)驗者的相關操(cao)作(zuo)以及當時(shi)的實(shi)驗環境密切相關，請務必準備充(chong)足的標本備份。

3. 不同批次的同一產品(pin)可能(neng)會有少許差別，如(ru)：檢測(ce)限、靈(ling)敏度以(yi)及(ji)顯(xian)色時間(jian)等(deng)，請依據試(shi)劑盒內說明書進行實(shi)驗操作，網站電子版說明書僅作參考。

4. 只(zhi)有(you)全部(bu)使用本(ben)(ben)試(shi)劑盒配套試(shi)劑才能保證檢測效果(guo)，不(bu)能混用其(qi)他(ta)制造商的(de)(de)(de)產品(pin)。只(zhi)有(you)嚴(yan)格遵(zun)守本(ben)(ben)試(shi)劑盒的(de)(de)(de)實驗說明(ming)才會得到最(zui)佳的(de)(de)(de)檢測結果(guo)。